PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 在木質(zhì)部發(fā)育中存在功能保守性

李海陽，趙立子*，趙巖秋

(1. 魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院，山東 煙臺， 264025；2. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺， 264025)

木材是木本植物次生木質(zhì)部長年累積的產(chǎn)物，次生木質(zhì)部發(fā)育是一個(gè)動態(tài)過程，包括維管形成層分裂、木質(zhì)部與韌皮部細(xì)胞分化、次生細(xì)胞壁形成等各個(gè)階段[1]。其中，木質(zhì)部細(xì)胞的分化是木材形成的關(guān)鍵。木本植物中楊樹（Populus）憑借其基因組小、適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、易于無性繁殖等特點(diǎn)，已被公認(rèn)是林木分子生物學(xué)研究的模式物種[2]。近年來，隨著對木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)研究的逐步深入，已有大量研究表明楊樹木質(zhì)部發(fā)育受多種遺傳和內(nèi)源因子調(diào)控，如激素、轉(zhuǎn)錄因子及多肽信號等[3]。其中，轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育的關(guān)鍵因子存在，已有大量研究報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育，如：XND1（XYLEM NAC DOMAIN 1）負(fù)調(diào)控木質(zhì)部導(dǎo)管分化[4]；油菜素內(nèi)酯對木質(zhì)部分化起到正向調(diào)控作用，且有利于促進(jìn)應(yīng)力木的形成[5]；生長調(diào)節(jié)因子PagGRF12a被顯性抑制可有效增加木質(zhì)部寬度，促進(jìn)木質(zhì)部發(fā)育[6]。綜上可見，木質(zhì)部發(fā)育受復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，從而影響木材形成過程。

KNOX 家族是一類重要的同源異型盒基因，廣泛存在并參與生物的發(fā)育進(jìn)程，并通過調(diào)控植物分生組織影響不同組織、器官的發(fā)育[7]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，I 類KNOX 包括4 個(gè) 成 員 分 別 是 ：STM（SHOOT MERISTEMLESS）、KNAT1（KNOTED1-LIKE FROM ARABIDOPSIS THALIANA1）、KNAT2和KNAT6。已有研究表明KNAT2與KNAT6分別在莖頂端分生組織的底部與邊緣處表達(dá)[8]；與此同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)前期對‘84K’楊（Populus alba×Populus glandulosa）中KNAT2和KNAT6的同源基因PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b的功能展開研究，已發(fā)現(xiàn)PagKNAT2/6b通過直接激活XND1a的表達(dá)抑制木質(zhì)部分化及次生細(xì)胞壁的合成[9]，但PagKNAT2/6a作為與PagKNAT2/6b進(jìn)化關(guān)系最近的成員，其在楊樹木質(zhì)部發(fā)育中的調(diào)控功能未知。

本研究為探究PagKNAT2/6a在木質(zhì)部發(fā)育中的功能，以PagKNAT2/6a為研究對象，通過‘84K ’ 楊樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得異常表達(dá)PagKNAT2/6a轉(zhuǎn)基因株系，借助GUS 染色實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR ） 比較分析PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b組織表達(dá)特異性，同時(shí)借助莖部解剖學(xué)分析其異常表達(dá)PagKNAT2/6a轉(zhuǎn)基因株系莖中木質(zhì)部分化差異，通過比較分析PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在楊樹木質(zhì)部中的表達(dá)定位及木質(zhì)部分化中的功能差異發(fā)現(xiàn)該基因在木質(zhì)部發(fā)育中可能存在的功能保守性。本研究對PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在楊樹木質(zhì)部發(fā)育中功能保守性的解析，以期為KNOX 類基因在木本植物木質(zhì)部發(fā)育上的保守性和分化性提供理論支持，并為KNOX 基因在定向分子設(shè)計(jì)育種工作開展中提供重要的基因資源。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列比對

通過NCBI中的BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）檢索‘84K’楊樹（Populus alba×Populus gllandulosa）中PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因序列，然后利用MEGA 軟件中Clustal Co 程序進(jìn)行多序列比對。

1.2 GUS 染色

取生長3～4 周的PPagKNAT2/6ba::GUS 組培苗整株浸泡于固定液（90%丙酮）中，4 ℃固定過夜；固定后的材料用配置好的GUS 染色緩沖液（0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉，0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉，2 mmol·L-1鐵氰化鉀，2 mmol·L-1亞鐵氰化鉀，現(xiàn)用現(xiàn)配)在冰上洗滌3 次，然后將材料轉(zhuǎn)移至GUS 染色液（ 1 mmol·L-1x-Gluc 先溶于DMF，后溶于染色緩沖液，并加0.2%的TritonX-100，現(xiàn)配現(xiàn)用）中，抽真空20～30 min，后置于37 ℃搖床70 r·min-1，染色10 h。最后用75%乙醇進(jìn)行脫色，取脫色后的莖或葉片，將其固定于5%～6%瓊脂中，待凝固后使用振動式切片機(jī)切片，后使用顯微鏡對GUS 信號的定位進(jìn)行觀察。GUS 染色實(shí)驗(yàn)包含2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系設(shè)置單株重復(fù)。

1.3 RNA 提取及qRT-PCR 分析下游基因表達(dá)量

采用華越洋植物RNA 提取試劑盒，分別提取‘84K’楊，過表達(dá)株系（OE6，OE18）的相同節(jié)間總RNA，然后以RNA 為模板按照 HiScript II Q RT SuperMix for Qpcr（+ gDNA wiper）試劑盒說明書合成cDNA，并利用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR（反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Tm 5 μL，引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL），以Actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。最后采用2-△△CT法計(jì)算莖植物組織相對表達(dá)量。同時(shí)，本研究選擇了細(xì)胞壁三大素（纖維素，半纖維素，木質(zhì)素）部分合成相關(guān)的基因（CESA4、CESA7A、CESA7B、CESA8A、CESA8B、GUX1a、GUX1b、PARVUS、4CL、C3H、COMT、CAD、LAC4、LAC17）通過qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行分析PagKNAT2/6a可能的下游靶基因，所有引物見表1。

表1 本研究中所用的引物序列 Table 1 The primer sequences used in this study.

1.4 震蕩切片與TBO 染色

將新鮮楊樹莖的節(jié)間切成1 cm 長，一端用膠水固定于樣品架，利用震蕩切片機(jī)對樣品進(jìn)行切片，切片厚度一般設(shè)置為60 μm，將切片收集至ddH2O 中，待染色觀察。染色時(shí)直接將染色液（0.5% 甲苯胺藍(lán)）滴到切片上，1 min 左右后用蒸餾水沖洗在熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 掃描電鏡分析

用雙面刀片迅速取下野生型及PagKNAT2/6a異常表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株新鮮的莖段，后將其置于裝有4%多聚甲醛中固定2 h，后經(jīng)過脫水，臨界點(diǎn)干燥，將莖段垂直放置于樣品臺上，噴金處理使莖段橫切面均勻噴上金粉，最后用掃描電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 氨基酸序列高度保守

根據(jù)PagKNAT2/6a（Pop_A08G045880）與PagKNAT2/6b（Pop_A10G047641）進(jìn)化關(guān)系， 本研究首先分析了PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b氨基酸序列的相似性，如圖1 所示，PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b氨基酸序列高度相似，且都包含HOMEBOX-1 保守的同源盒，表明PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因同源性相對較高，序列相對保守，為此推測PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因在楊樹發(fā)育中可能存在功能保守性。

圖1 PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 氨基酸序列比對Fig. 1 PagKNAT2/6a and PagKNAT2/6b amino acid sequence alignment.

2.2 PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 具有相似的表達(dá)模式

為比較分析PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在楊樹不同組織中的表達(dá)特異性，本研究首先借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，檢測PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因在‘84K’楊樹根、根尖、莖、莖尖、幼嫩葉及成熟葉6 個(gè)部位中的組織表達(dá)變化（圖2A），結(jié)果顯示PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因均在楊樹莖、莖尖以及幼嫩葉片中表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。與此同時(shí)，本研究克隆了PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因啟動子序列，將其融合至含有GUS 報(bào)告基因的載體中，通過穩(wěn)定的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得PPagKNAT2/6a::GUS 與PPagKNAT2/6b::GUS轉(zhuǎn)基因楊樹并進(jìn)行GUS 染色實(shí)驗(yàn)分析其表達(dá)定位（圖2B 與2C）。結(jié)果顯示PagKNAT2/6b基因（圖2B）在幼嫩節(jié)間與葉片中GUS 信號強(qiáng)于PagKNAT2/6a（圖2C），且在GUS 信號觀察中發(fā)現(xiàn)PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b在幼嫩葉片與幼嫩莖段中的表達(dá)均強(qiáng)于成熟葉片與根。

圖2 PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 基因組織表達(dá)特異性分析Fig. 2 Tissue expression specificity analysis of PagKNAT2/6a and PagKNAT2/6b genes

隨后， 為深入研究PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因在莖中的表達(dá)特性，通過GUS 染色放大圖發(fā)現(xiàn)PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b均特異在木質(zhì)部與韌皮部表達(dá)（圖3A、C），但利用Popgenie 網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)PagKNAT2/6b表達(dá)量在木質(zhì)部表達(dá)量顯著高于PagKNAT2/6a（圖3B、3D）。根據(jù)上述結(jié)果推測，楊樹PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b基因可能均參與楊樹莖部木質(zhì)部發(fā)育方面的調(diào)控。

圖3 PagKNAT2/6a 與PagKNAT2/6b 基因在莖中高表達(dá)Fig. 3 PagKNAT2/6a and PagKNAT2/6b genes are highly expressed in stems

2.3 PagKNAT2/6a 異常表達(dá)影響木質(zhì)部分化與次生細(xì)胞壁合成

基于PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在楊樹莖中木質(zhì)部區(qū)域特異性表達(dá)，為深入比較分析PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在木質(zhì)部發(fā)育中的功能，本研究在前期分別創(chuàng)制了PagKNAT2/6a過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹（PagKNAT2/6aOE，OE6與OE18）和PagKNAT2/6a抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹（PagKNAT2/6aSRDX，DR3 與DR15）轉(zhuǎn)基因株系（已發(fā)表）。與此同時(shí)，對生長一個(gè)月的不同轉(zhuǎn)基因株系的第八節(jié)間分別進(jìn)行切片（圖4A）及掃描電鏡分析（圖4B）。結(jié)果顯示：PagKNAT2/6aOE 株系的木質(zhì)部寬度和次生壁沉積厚度顯著窄于野生型（CK），而PagKNAT2/6aSRDX 株系莖中木質(zhì)部顯著寬于CK。該結(jié)果與研究團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)的PagKNAT2/6b基因?qū)δ举|(zhì)部的影響相似，說明PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在木質(zhì)部分化調(diào)控上的保守性。

圖4 PagKNAT2/6a 異常表達(dá)影響莖中木質(zhì)部分化與木質(zhì)部細(xì)胞壁厚度Fig. 4 Abnormal expression of PagKNAT2/6a affects woody partialization and xylem cell wall thickness in stems

2.4 PagKNAT2/6a 調(diào)控壁合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

眾所周知，次生細(xì)胞壁是木質(zhì)部的主要組成部分，其組成成分對木材品質(zhì)有直接的影響，基于PagKNAT2/6b基因抑制次生壁合成相關(guān)基因的表達(dá)從而抑制楊樹莖中木質(zhì)部分化的研究基礎(chǔ)[10]；為此，推測PagKNAT2/6a基因可能通過調(diào)控次生壁合成基因來影響木質(zhì)部的發(fā)育。為進(jìn)一步解釋PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b異常表達(dá)與次生壁合成相關(guān)基因之間的調(diào)控關(guān)系，本研究通過qRT-PCR 分析了細(xì)胞壁三大素（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素）合成相關(guān)基因在CK、PagKNAT2/6aOE 植株莖中的表達(dá)變化（圖5）。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：相比于CK，參與調(diào)控次生壁合成的纖維素、木糖（半纖維素中主要組分）、木質(zhì)素等相關(guān)基因（COMT、CAD、LAC4、LAC17、CesA4、CesA7A、CesA7B、CesA8A、CesA8B）在PagKNAT2/6aOE 莖中均表現(xiàn)出下調(diào)表達(dá)的趨勢，其中，纖維素合成相關(guān)的CesA類基因的下調(diào)趨勢最顯著（圖5C）。根據(jù)以上結(jié)果可知，PagKNAT2/6a基因通過調(diào)控次生壁合成相關(guān)基因的表達(dá)影響木質(zhì)部發(fā)育，且PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在對次生壁合成相關(guān)基因的調(diào)控上具有保守性。

圖5 PagKNAT2/6a 異常表達(dá)影響細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 5 Aberrant expression of PagKNAT2/6a affects the expression of genes related to cell wall synthesis

3 討論

次生木質(zhì)部由維管形成層細(xì)胞通過平周、垂周分裂不斷增殖，位于內(nèi)側(cè)的細(xì)胞不斷分化，伴隨次生壁形成和細(xì)胞內(nèi)容物溶解從而形成成熟的次生木質(zhì)部[11]。次生木質(zhì)部發(fā)育是木材生產(chǎn)的生物學(xué)基礎(chǔ)，其發(fā)育調(diào)控原理一直是林木分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中關(guān)注的核心科學(xué)問題。已有研究表明，木質(zhì)部發(fā)育受多種因子調(diào)控，如細(xì)胞比例，次生細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組成，植物激素和關(guān)鍵基因等。目前，次生壁合成被認(rèn)為由三級調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，調(diào)控木質(zhì)部細(xì)胞分化的VND 類轉(zhuǎn)錄因子，其可直接調(diào)控第二級轉(zhuǎn)錄因子MYB46、MYB83的表達(dá)，后者又作為重要開關(guān)，調(diào)控細(xì)胞壁三大素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)[12]。與此同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)KNOX 基因參與調(diào)控木本植物形成層分化，其中楊樹中Ⅰ類KNOX 成員ARK1與ARK2均在形成層區(qū)域表達(dá)[13-14]，而PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在形成層兩側(cè)表達(dá)，可見不同KNOX 類成員分別影響形成層的分裂及子細(xì)胞的分化過程[15]。

木材來自形成層的活動，調(diào)控形成層活動的基因會影響木質(zhì)部的發(fā)育，楊樹中PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b均在形成層兩側(cè)區(qū)域有較高的表達(dá)量，分析PagKNAT2/6b在木質(zhì)部發(fā)育中的功能，發(fā)現(xiàn)PagKNAT2/6b過表達(dá)會使木質(zhì)部分化受到抑制[9]。本研究著重比較了PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在對楊樹莖中木質(zhì)部的發(fā)育調(diào)控上的異同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在木質(zhì)部發(fā)育中的功能存在一定保守性，但從莖部切片結(jié)果可知（圖4A），PagKNAT2/6b對木質(zhì)部發(fā)育的影響大于PagKNAT2/6a。

4 結(jié)論

本研究在探究PagKNAT2/6a基因在木質(zhì)部發(fā)育中的功能，同時(shí)對楊樹PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在木質(zhì)部發(fā)育中功能的保守性進(jìn)行分析，確定了PagKNAT2/6a與PagKNAT2/6b在木質(zhì)部發(fā)育與次生壁合成中的功能保守性，本研究不僅為木材形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立提供有效線索，而且為木本植物分子育種工作提供理論基礎(chǔ)。