不同油茶品種苗對高溫脅迫的生理響應及耐熱性評價

傅志強，張 恒，劉 禎，奚如春,2*

(1. 華南農業大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642；2. 廣東省森林植物種質創新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642)

高溫脅迫是主要非生物脅迫之一，也是在整個生命周期中影響植物生長發育的關鍵環境因素[1-2]。在高溫下不僅會對植物外部造成不可逆的機械損傷，還會導致植物體內部干物質含量減少[3]、光合作用減弱[4]、抗氧化酶活性降低[5]。近年來，隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣頻發，高溫脅迫對林業發展危害性增大，研究表明，長時間的高溫脅迫對木荷（Schima superbaGaertn. et Champ）[6]、香樟（Cinnamomum camphora(L.) Presl）[7]、楊樹（PopulusL. ）[8]和大葉桉（Eucalyptus robustaSmith）[9]等重要用材樹種帶來了嚴重的負面影響。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是我國特有的優質木本油料樹種，屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木，多栽培于南方丘陵地區，極具生產應用價值[10-11]；茶油又稱為東方橄欖油，具有較高的營養價值和藥用價值[12]。我國油茶種植面積和產業產值每年都在增加[13]，油茶雖適應性較強，但高溫條件仍會對其生長發育造成一定程度的影響[14]，尤其是南方夏季的持續高溫天氣，容易導致新造油茶林死亡[15]。研究表明，高溫干旱是影響油茶生長發育的關鍵因素之一[16]，因此，生態型適生油茶品種評價與篩選意義現實而重大。篩選耐熱品種是降低高溫對植物危害的有效措施，在篩選過程中通常采用主成分分析和隸屬函數分析相結合，得到的綜合評價值（D值）在評價體系中應用廣泛[17-18]。

本研究以我國15 個油茶品種的苗木為試驗材料，通過調查測定其在高溫脅迫下的生理響應，并進行耐熱性綜合評價，旨在為油茶耐熱生理機制研究和耐熱品種選用提供理論技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗區域位于廣東省廣州市天河區華南農業大學教學試驗基地（113°21′26″ E, 23°9′26″ N），屬亞熱帶季風氣候，溫暖多雨、陽光充足、全年水熱同期，年平均氣溫23.1 ℃，最高溫39.1 ℃，最低溫-0.9 ℃，最冷月為1 月，平均氣溫13.3 ℃，最熱月為8 月，平均氣溫28.8 ℃。年降水量1 800 mm，4—9 月的降水量占全年降水量的80%，尤以5—8 月最高，占全年降水量的62%，該區域年平均濕度為79%。

1.2 試驗材料與設計

1.2.1 試驗材料 選擇我國各省（區）現行主推15 個油茶品種（表1），以各品種3 a 生嫁接苗為試驗材料。

表1 參試品種基本情況Table 1 Basic information of participating species

1.2.2 試驗設計 于2022 年7 月17 日至7 月31 日開展為期15 d 的控制溫度處理。試驗采用雙因素完全隨機區組設計，試驗設計分別設置兩種溫度處理，即高溫脅迫組（HT）和對照組（CK），每個油茶品種設置5 次生物學重復，每個品種各5 株，分開擺放，共150 株。試驗期間高溫脅迫處理的實測溫度范圍是41.0 ～45.0 ℃，均值為43.4 ℃，對照組溫度范圍33.3～36.2 ℃，均值為34.7 ℃。具體技術措施是高溫脅迫組將參試油茶幼苗分別放置于溫室大棚進行覆膜增溫處理，通過溫濕度記錄儀（RC-4HC）實時監測溫度，連續處理15 d；對照組不進行覆膜增溫處理。除溫度控制外，其他按常規苗圃管理。

1.2.3 樣品采集 試驗的第16 d 上午8:00～9:00對葉片樣品進行采集，每個品種選取5 株，每個植株采集中上部完整健康的葉片10 枚，各指標進行5 次重復測定。

1.3 測定指標及方法

（1）葉片相對含水量及干物質含量：將選定的葉片放入密封容器中，然后測定葉面積葉鮮質量(FW)/g；將新鮮葉子放入4 ℃純凈水中浸泡48 h 后測量水分飽和狀態時的葉片質量(TW)/g；將葉片放入烘箱70 ℃干燥至恒質量測定葉干質量(DW)/g，計算葉片相對含水量（RWC）/%以及葉片干物質含量(DMC)/(g·g-1)：

（2）光合色素含量測定：采用乙醇浸提法[19]，取潔凈新鮮油茶葉片，去除中脈，剪碎成條狀，稱取0.1 g。將稱取的葉片放置于15 mL 離心管中，加入10 mL95%的乙醇，混勻，避光處理，浸泡至葉片發白，色素完全被萃取到溶液中。利用紫外分光光度計（UV-2600, 上海恒平）測定提取的溶液在649 nm、665 nm、470 nm 下的OD值，并計算葉綠素a 含量（Chla）/(mg·g-1)、葉綠素b 含量（Chlb）/(mg·g-1)、葉綠素總含量（Chl）/(mg·g-1)、類胡蘿卜素含量（Car）/(mg·g-1)：

（3）植物滲透調節物質及抗氧化酶活性測定：采集油茶枝稍3～5 片1 年生正常功能葉，洗凈表明浮土和灰塵，擦干后迅速放入液氮罐帶回實驗室至-80 ℃超低溫冰箱保存。測定滲透調節物質及抗氧化酶活性所用試劑盒均購自蘇州科銘生物技術有限公司（中國，蘇州），采用微量法測定，每組處理設3 個重復。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量采用蒽酮硫酸法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250 法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法；過氧化物歧化酶（POD）活性采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性采用碘量滴定法[20]。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2021 進行統計與分析，使用SPSS 26.0 軟件進行Pearson 相關性分析、差異顯著性分析（同一品種不同溫度處理間采用T 檢驗（p＜0.05），同一溫度不同品種間采用Duncan 法（p＜0.05））、主成分分析、隸屬函數分析；使用Origin 2018 繪制柱狀圖。

（1）耐熱系數。首先將原始數據以相對指標為單位進行無量綱標準化處理，求得各項生理指標的耐熱系數，使用耐熱系數進行主成分分析，耐熱系數（heat tolerance coefficient, HTC）=高溫脅迫性狀值/對照性狀值。

（2）隸屬函數分析。隸屬函數值的計算方法參照于朱亞迪等[17]的方法。隸屬函數值采用以下公式計算：

式中U（Xj）為各油茶品種第j個主成分的隸屬函數值，Xj為某綜合指標，j=1,2,3,…,n；Xmin和Xmax分別表示所有品種中第j個綜合指標的最小值和最大值。

（3）指標權重。權重的計算方法參照于凌瑞等[21]，采用以下公式計算：

式中Wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度（權重），Pj為某綜合指標的貢獻率。

（4）綜合評價。采用主成分分析和隸屬函數分析相結合的方法計算高溫脅迫下耐熱綜合評價值（D值）評價油茶耐熱性，D值越大，表明品種指標評價的綜合得分越高，D值采用以下公式進行計算：

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對油茶葉片相對含水量及干物質含量的影響

高溫脅迫引起油茶葉片中相對含水量和干物質含量降低，不同油茶品種降低的程度不同（圖1）。相對含水量多重比較結果表明：對照組（CK）內各品種間葉片相對含水量均無顯著差異（p＞0.05），高溫脅迫處理（HT）后品種間，贛州油1 號的相對含水量除與贛州油7 號無顯著差異以外，而與其他各品種之間均存在顯著差異（p＜0.05），較CK 下降了23.13%；贛州油7 號分別與15 個品種中的7 個品種(注：岑軟2 號、長4 號、長林53 號、華金、華鑫、贛無2 和粵韶77-1)在相對含水量上有顯著差異（p＜0.05）（圖1）；粵韶75-2 分別與長林53 號、華金、贛州油1 號和粵韶77-1 間也有顯著差異（p＜0.05）。同一品種下，高溫處理與其相應對照處理間存在顯著差異的品種有6 個，包括長林40 號、湘林210、贛州油1 號、贛州油7 號、贛石83-4 和粵韶75-2（p＜0.05）。同一品種下葉片干物質含量，華金、華碩、湘林210、贛州油7 號和粵韶77-1 的高溫脅迫后與其相應CK 相比均顯著降低（p＜0.05），其中湘林210 降低幅度最大，為15.79%，說明高溫對該品種干物質積累和轉運的影響較大，而其余9 個品種在溫度處理間無顯著差異（p＞0.05），說明這9 個品種相對耐高溫脅迫；同時，高溫脅迫組內或對照組內，葉片干物質含量在品種間均無顯著差異（p＞0.05）。

圖1 高溫條件對不同油茶葉片相對含水量和干物質含量的影響Fig. 1 Effect of high temperature stress on the relative water content and dry matter content of different Camellia oleifera leaves

2.2 高溫脅迫對油茶葉片光合色素含量的影響

圖2 為15 個油茶品種在CK 和高溫處理條件下葉片中光合色素含量的變化情況，不同品種在高溫脅迫下葉片中光合色素含量均有不同程度的降低。同一品種下，除長林53 號、華鑫、華碩和贛無2 以外，其他11 個品種葉片中葉綠素a 含量較CK 顯著降低（p＜0.05），高溫脅迫處理（HT）后品種間，贛石83-4 的葉綠素a 含量除與華金無顯著差異外（p＞0.05），和其他品種均有顯著差異（p＜0.05），較CK 降低了33.58%，相較于其他品種為降幅最大，說明其葉綠素a 含量受到高溫影響較大；華金與除長林40 號、贛石83-4 和粵韶75-2 外的11 個品種之間存在顯著差異（p＜0.05）。葉綠素b 含量除華金、華鑫、華碩、湘林210 和粵韶75-2 外其他品種在高溫脅迫處理和CK 處理之間差異顯著（p＜0.05），高溫脅迫處理（HT）下，華碩的葉綠素b 含量與長林4 號無顯著差異（p＞0.05），但與其余的13 個品種差異顯著（p＜0.05）。葉綠素總含量除長林53 號和華碩外其他品種在高溫脅迫處理和CK 處理之間均存在顯著差異（p＜0.05），高溫脅迫下贛石83-4 與華金無顯著差異（p＞0.05），而與其他品種均有顯著差異（p＜0.05）。高溫脅迫降低了類胡蘿卜素含量，在高溫條件下，贛石83-4 的類胡蘿卜素含量與其他品種之間存在顯著差異（p＜0.05），較CK 相比降低了41.48%，而除贛石83-4 外，長林40 號與除華金外其他品種間也有顯著差異(p＜0.05)。

圖2 高溫脅迫對不同油茶葉片光合色素含量的影響Fig. 2 Effect of high temperature stress on photosynthetic pigment content of different Camellia oleifera leaves

2.3 高溫脅迫對油茶葉片丙二醛含量及滲透調節物質的影響

在高溫脅迫下不同油茶品種的MDA 含量均增加（圖3），高溫脅迫處理與CK 處理相比，除岑軟2 號、岑軟3 號、華鑫和粵韶77-1 外，其他品種均顯著增加（p＜0.05）。高溫脅迫下，長林4 號的MDA 含量與其他各品種間存在顯著差異（p＜0.05），與CK 相比增加了89.33%，為增幅最大，說明在高溫脅迫下其膜脂過氧化程度較高；贛無2 與岑軟2 號、湘林210 之間無顯著差異（p＞0.05），但與其余品種存在顯著差異（p＜0.05），增幅為38.13%。除岑軟2 號、岑軟3 號、華金、贛州油7 號外，其余品種可溶性糖含量在高溫脅迫組和CK 組之間均有顯著差異（p＜0.05），其中贛石83-4 在高溫處理后可溶性糖含量顯著低于CK 處理，降低幅度為20.16%；高溫脅迫后華鑫的可溶性糖含量與除長林40 號、湘林210 號和贛州油1 號外的11 個品種之間有顯著差異（p＜0.05），增幅為31.54%。高溫脅迫下各油茶品種的可溶性蛋白含量與CK 相比均顯著升高（p＜0.05），不同品種間，贛無2 與其他品種差異顯著（p＜0.05），增幅為321.26%，表明贛無2 可以通過調節可溶性蛋白含量來應對高溫脅迫，此外，贛州油7 號與除岑軟3 號、粵韶75-2和粵韶77-1 外的11 個品種也有顯著差異（p＜0.05）。

圖3 高溫脅迫對不同油茶葉片丙二醛及滲透調節物質含量的影響Fig. 3 Effect of high temperature stress on the content of MDA and osmoregulatory substances in different Camellia oleifera leaves

2.4 高溫脅迫對油茶葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4 可知，高溫脅迫下，不同油茶品種的SOD 活性升高，多重比較的結果表明，除岑軟2 號和華鑫外，高溫處理與CK 處理均有顯著差異（p＜0.05），在高溫條件下，岑軟3 號、贛州油1 號和贛州油7 號的SOD 活性與其他品種之間差異顯著（p＜0.05）；此外，贛無2 與除岑軟2 號、贛石83-4、粵韶75-2 和粵韶77-1 外的10 個品種存在顯著差異（p＜0.05）。高溫脅迫下不同油茶品種的POD 活性全都顯著高于CK（p＜0.05），在高溫條件下，長林4 號、長林40 號、長林53 號、華金和華碩的POD 活性顯著高于其他10 個品種的POD 活性（p＜0.05），且這10 個品種間POD 活性均無顯著差異（p＞0.05）。高溫脅迫下不同油茶品種的CAT 活性與CK 相比均顯著升高（p＜0.05），高溫脅迫后粵韶75-2 的CAT 活性與其他品種差異顯著（p＜0.05），增幅為249.90%；同時，高溫脅迫后的CAT 活性，岑軟3 號和粵韶77-1 間無顯著差異（p＞0.05），但這兩個品種與其余品種間存在顯著差異（p＜0.05）。

圖4 高溫脅迫對不同油茶葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effect of high temperature stress on the antioxidant enzyme activities of different Camellia oleifera leaves

2.5 高溫脅迫下油茶各項生理指標的相關性分析

對高溫脅迫下油茶各項生理指標的耐熱系數進行相關性分析，結果如表2。由表2 可知，干物質含量與葉綠素b 含量存在顯著負相關關系（p＜0.05），葉綠素a 含量和葉綠素總含量之間存在極顯著相關關系（p＜0.01），與葉綠素b 含量和類胡蘿卜素含量存在顯著相關關系（p＜0.05）；葉綠素b 含量與葉綠素總含量存在極顯著相關關系（p＜0.01），與可溶性糖含量、SOD 活性存在顯著相關關系（p＜0.05）；葉綠素總含量與類胡蘿卜素含量存在顯著正相關關系，與SOD 活性存在顯著負相關關系（p＜0.05）；類胡蘿卜素含量與SOD 活性存在顯著負相關關系（p＜0.05）。各指標間存在不同程度的相關性，由此可見，植物的耐旱性是一個復雜的綜合性狀，其耐熱性還需要通過多個指標進行判斷。

表2 油茶各項生理指標的相關性分析 Table 2 Correlation analysis of various physiological indicators of Camellia oleifera seedlings

2.6 不同油茶品種耐熱性分析及綜合評價

對葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量等9 個生理指標的耐熱系數進行主成分分析（表3），提取出4 個主成分，累積貢獻率為87.042%，具有較強的代表性。油茶耐熱性評價主成分1 中葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量、類胡蘿卜素含量和SOD 活性的載荷較大，可反映原始數據的43.918%；主成分2 中可溶性蛋白含量的載荷最大，可反映原始數據的18.716%；決定主成分3 的主要是CAT 活性，可反映原始數據信息中的13.134%；決定主成分4 的主要是可溶性糖含量，可反映出原始數據中的11.274%。

表3 主成分在各項指標上的因子載荷及貢獻率 Table 3 Factor loadings and contributions of principal components on each indicator

為進一步明確4 個綜合指標（主成分）對不同油茶品種的貢獻度，根據公式（7）、（8）、（9）計算得到各品種在不同綜合指標下的隸屬函數值、權重和綜合評價值（表4），并通過綜合評價值（D值）來判斷油茶耐熱性的強弱。耐熱性強弱順序為華金＞贛州油1 號＞華碩＞岑軟2 號＞湘林210＞贛無2＞長林53 號＞粵韶75-2＞粵韶77-1＞長林4 號＞岑軟3 號＞華鑫＞長林40 號＞贛州油7 號＞贛石83-4。由表4 可知，華金的D值最大，為0.844，表明其在高溫下具有較強的耐受性，而贛石83-4 的D值最小，為0.174 ，說明其對高溫脅迫較為敏感。

表4 高溫脅迫下不同油茶品種的隸屬函數值（U）和綜合評價值（D）排序 Table 4 Affiliation function values and D-value ranking of different Camellia oleifera species under high temperature stress

3 討論

不同植物品種對高溫脅迫的生理響應存在差異，也會通過多種生理生化過程來調節體內環境以適應高溫條件，高溫環境會對植物體內的多種代謝途徑產生負面影響[22-23]。植物葉片中相對含水量能夠直接反映植物的保水能力，葉片干物質含量能夠間接反映植物對高溫環境的耐受性[24]。本試驗的研究結果表明，在不同油茶品種在受到高溫脅迫后，葉片相對含水量和干物質含量呈現不同程度的降低，僅從相對含水量和干物質含量這兩個指標來看，相對含水量岑軟2 號下降的幅度最低，說明其葉片在高溫下具有較強的保水能力，耐熱性相對更好，干物質含量長林40 號下降幅度最低，說明高溫對其干物質含量的積累造成了較大的影響。

葉綠素在植物感知光能中起重要的作用，研究證實在外界脅迫條件下葉綠素含量的變化情況能夠反映植物的抗性[25]。本研究中，在高溫脅迫下15 個油茶品種的葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量和類胡蘿卜素含量均呈下降趨勢，這與前人對東方鐵筷子（Helleborus orientalis）在高溫脅迫下葉綠素含量的變化情況一致[26]。在15 個油茶品種中，華金和華碩葉綠素總含量下降最少，贛石83-4 葉綠素總含量下降最多，表明華金和華碩的耐熱性要強于贛石83-4，隸屬函數分析的結果同樣也證實了這一結論。

植物長時間處在高溫條件下，會導致膜脂過氧化，丙二醛是膜脂過氧化的重要產物之一[27]，在本研究中丙二醛含量升高的幅度因品種而異，華鑫、岑軟2 號和岑軟3 號丙二醛含量升高的幅度較低，長林4 號、長林53、華金和贛州油7 升高的幅度較大，丙二醛含量上升較大表明在高溫脅迫下膜的受損程度越大[28]。可溶性糖和可溶性蛋白可以有效的維持植物細胞受到外界環境干擾時的穩態，因此其會在植物受到脅迫時含量上升[29]，但在本研究中贛石83-4 的可溶性糖含量出現下降，這可能是因為在高溫脅迫下與光合作用光反應有關酶活性的降低或者失活，導致光合產物的總量降低，進而造成可溶性糖含量下降的情況[30]。抗氧化酶可以延緩膜脂的氧化過程，從而保護細胞內的成分免受損傷，因此，在植物受到外界脅迫時，抗氧化酶活性會提升，從而保護細胞免受活性氧（ROS）損傷[31-32]，高溫脅迫下不同油茶品種的SOD、POD和CAT 活性均上升，這與韓一林等[33]的研究結果相吻合，說明油茶在應對高溫脅迫時主要是通過調節3 種抗氧化酶的活性共同來應對高溫脅迫。綜上所述，認為華金、贛州油1 號、華碩、岑軟2 號和湘林210 耐熱性較強的原因可能是：在高溫環境下能夠維持較高的葉綠素含量，以此來降低高溫脅迫對葉片形態和光合作用的損傷，同時在高溫脅迫下形成相應的保護機制，通過調節可溶性蛋白含量以及提高SOD、POD 活性來保持膜的透性和穩定性[34-35]。

此外，高溫脅迫對植物的危害不僅表現在其生理上，還有外部形態，例如：高溫脅迫下，阻礙植物生長[36]，使植物嚴重萎蔫、干枯變黃[37]，加速植物葉片衰老甚至死亡[38]等。本研究引入了較為全面的生理指標來評價不同油茶品種的耐熱性，結合主成分分析的結果，并將9 個相關性較強的生理指標轉換為4 個全新且獨立的綜合指標，此方法已在多種農作物和樹種上使用，較為科學合理。不過僅從油茶對高溫脅迫的生理響應還不足以揭示其耐高溫機制，還需要在分子的水平上進行更深層次的分析。

4 結論

15 個油茶品種應對高溫脅迫的方式有所不同，采用主成分分析和隸屬函數分析的結果表明：15 個油茶品種的耐熱性強弱排序為華金＞贛州油1 號＞華碩＞岑軟2 號＞湘林210＞贛無2＞長林53 號＞粵韶75-2＞粵韶77-1＞長林4 號＞岑軟3 號＞華鑫＞長林40 號＞贛州油7 號＞贛石83-4，在夏季溫度較高的地區，建議選用耐熱性較強的華金、贛州油1 號、華碩、岑軟2 號和湘林210 進行引種栽培，同時可作為親本來培育耐熱新品種。