黃連素通過重塑腸道菌群和調節PI3K/AKT信號通路改善多囊卵巢綜合征小鼠的作用機制研究

楊宇琦,吳麗娜,孫克,邢偉園,侯越,張麗文

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性最常見的生殖內分泌疾病,也是育齡期女性不孕的重要原因[1]。PCOS發病機制較為復雜,其治療方法具有局限性。因此,尋找有效的治療藥物至關重要。黃連素(berberine,BBR)是一種天然異喹啉生物堿,具有降糖、降脂和抗炎等有益作用。據報道,BBR對PCOS顯示出良好的臨床療效[2],但其具體機制尚未可知。研究表明,腸道菌群及其代謝產物失調與PCOS的生殖和代謝表型存在聯系[3-4],靶向調節腸道菌群可改善PCOS[5-6]。由于BBR吸收率低,其分解代謝主要集中在胃腸道,可能有效調節腸道菌群和腸道黏膜屏障[7]。因此,本研究采用來曲唑誘導的PCOS小鼠模型,利用16S rDNA基因測序技術,研究BBR對PCOS腸道菌群的調節作用及可能機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:清潔級健康雌性C57BL/6J小鼠24只,6～8周齡,體質量15～20 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,合格證號:SCXK(京)2020-0004。飼養在特定的無菌條件下,標準溫度(22±2)℃,相對濕度45%～70 %,光暗周期12/12 h,并給予自由飲水和標準飲食。屏障環境適應1周后進行后續實驗。(2)試藥試劑:來曲唑(貨號H199991001)購自江蘇恒瑞醫藥公司;達英-35(貨號j20140114)購自德國拜耳公司;黃連素(批號B21449)購自上海源葉生物公司;睪酮(T,貨號H090-1-1)、雌二醇(E2,貨號H102-1-1)和促黃體生成素(LH,貨號H206-1-2)購自南京建成公司;空腹胰島素(FINS,貨號ml060484)和卵泡刺激素(FSH,貨號ml059034)ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物公司;HE檢測試劑盒(貨號G1003)購自武漢塞維爾生物公司;抗Occludin(GB111401)、Claudin-1(GB14066)抗體購自美國Servicebio公司;抗PI3K(4255S)和PI3K-p85(4292S) 抗體購自美國CST公司;抗AKT(ab8805)和AKT-pT30磷酸化抗體(ab32445)購自美國Abcam公司。(3)儀器設備:離心機(AXTGL16M)購自江蘇恒諾儀器制造有限公司;切片機(RM2235)和石蠟包埋機(G1150H)購自德國徠卡公司;I-Sanger生信云平臺(https://www.i-sanger.com/)。

1.2 PCOS模型構建及分組處理 2021年6月—2022年6月在復旦大學附屬上海市第五人民醫院實驗動物中心進行實驗。采用隨機數字表法將24只雌鼠分為正常對照組、模型(PCOS)組、陽性藥達英-35(0.2 mg·kg-1·d-1)組和BBR(100 mg·kg-1·d-1)組,每組6只。除正常對照組外,其余小鼠均予以來曲唑(1 mg·kg-1·d-1,溶于1%羧甲基纖維素)灌胃誘導PCOS模型,連續21 d,正常對照組給予等容積0.9%氯化鈉溶液。以第1次給來曲唑為第1天計算,第8天開始連續每日取小鼠陰道上皮細胞涂片觀察脫落細胞改變,分析動情周期變化,以陰道上皮細胞持續角化者為造模成功。造模成功后,第22天開始給予相應劑量藥物連續灌胃治療14 d,正常對照組和PCOS組給予等容積0.9%氯化鈉溶液。實驗期間,每周監測小鼠體質量。實驗結束后,禁食10 h后過量麻醉處死,收集血清、雙側卵巢和結腸作進一步分析。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 16S rDNA基因測序檢測各組小鼠腸道菌群變化:實驗結束后,收集各組小鼠糞便樣本,按照文獻[8]報道方法,從小鼠糞便樣本中提取微生物基因組DNA。PCR擴增方法如下:98℃ 2 min,隨后在98℃ 15 s,55℃ 30 s, 72℃ 30 s下循環25次,最后在72℃延伸5 min。使用正向引物338 F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806 R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')在72℃下進行最終延長5 min,制備文庫(連接接頭和指示劑)和純化。微生物組生物信息學采用QIIME2 2019.4進行,并根據官方教程(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)進行輕微修改。基于操作分類單元(OTU)注釋,結合門、綱、目、科、屬等分類水平,生成相對豐度譜。采用Pearson相關系數矩陣進行UPGMA聚類,并在R統計軟件包中開發自定義腳本生成熱圖,對差異較大的每個類群或OTU進行評價。

1.3.2 血清激素水平測定:各組小鼠末次給藥后,于眼眶后靜脈叢采血0.5～1.0 ml,室溫靜置2 h后,4℃離心收集上層血清。利用酶聯免疫吸附法并按照試劑盒說明書檢測血清激素水平:T、E2、FSH、LH和FINS。

1.3.3 胰島素代謝相關指標測定:上述血液以 Hitachi-7600自動生化分析儀測量空腹血糖(FPG);分別根據公式[FINS(μIU/ml)×FPG (mmol/L)/22.5]和1/[FPG (mmol/L) × FINS(μIU/ml)]計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)和胰島素敏感系數(ISI)。

1.3.4 HE染色檢測小鼠卵巢病理結構:取各組小鼠卵巢組織,4℃下以4%多聚甲醛固定48 h,常規石蠟包埋,切片厚5 μm。利用HE染色試劑盒,并按照說明書步驟行HE染色。光鏡下評估創面組織形態學變化。

1.3.5 結腸Occludin、Claudin-1表達:將結腸組織切片放入65℃烤箱烘烤30 min后,二甲苯脫蠟,酒精梯度復水。在0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中煮沸20 min,抗原修復。3% H2O2封閉切片5 min后,室溫下山羊血清封閉15 min,分別用緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的特異性一抗(1∶200)4℃下孵育過夜;次日,用生物素標記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶在室溫下各孵育15 min。3,3'二氨基聯苯胺(DAB)顯色5 min,蘇木精復染。使用光學顯微鏡獲得圖像,陽性結果呈棕褐色,并進行蛋白定量分析。

1.3.6 Western-blot檢測小鼠卵巢組織PI3K/AKT通路相關蛋白表達:各組小鼠卵巢組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中進行裂解,并利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。20 μg卵巢蛋白經10% SDS-PAGE電泳分離,并在100 V下轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上60～80 min。非特異性結合點在室溫下用 5%脫脂牛奶在三相緩沖鹽水(TBS-T)中阻斷1 h后,用 PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶300)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶300)和 β-actin(1∶5 000)的一抗孵育PVDF膜。次日,用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)作為二抗,以β-actin為內參,采用Image J軟件進行定量分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠腸道菌群豐度和多樣性比較

2.1.1 OUT分析及物種組成分析:正常對照組、PCOS組、達英-35組和BBR組特有的OTU數分別為9 499(25.04%)、6 534(17.32%)、7 089(18.79%)和7 212(19.11%)。根據OUT聚類的結果,可獲得4組小鼠在門、綱、目、科、屬、種水平的豐度信息,見表1。

表1 4組小鼠腸道各級微生物分類群的數量

2.1.2 α多樣性分析:正常對照組、PCOS組、達英-35組和BBR組小鼠腸道菌群的Simpson指數分別為0.986 2、0.472 3、0.887 6和0.978 4,Shannon指數分別為9.089 2、3.234 1、8.672 8和8.423 6,4組間Simpson和Shannon指數比較,差異有統計學意義(P<0.001)。

2.1.3 β多樣性分析:剔除遠離總體的部分樣本后,非加權主坐標分析(PCoA)結果表明,4組腸道菌群組成有明顯差異。Axis 1和Axis 2軸對結果的解釋度分別為7.3%和5.5%,見圖1。

圖1 4組小鼠PCoA分析結果

2.1.4 物種差異分析:

2.1.4.1 門水平菌群豐度比較 4組小鼠腸道門水平菌群豐度比較(前20位),菌群組成以厚壁桿菌門和擬桿菌門為主。正常對照組、PCOS組、達英-35組和BBR組厚壁桿菌門占比分別為(72.54±2.36)%、(72.58±2.28)%、(76.81±3.23)%和(74.23±2.98)%,擬桿菌門占比分別為(25.87±1.67)%、(27.13±1.89)%、(21.67±1.62)%和(24.13±1.87)%。4組間厚壁桿菌門和擬桿菌門豐度比較差異無統計學意義(F/P=0.173/0.894,0.241/0.812)。

2.1.4.2 屬水平菌群豐度比較 在屬水平上,與正常對照組比較,PCOS組小鼠中布勞特氏菌屬(Blautia)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、孿生球菌屬(Gemella)和梭形桿菌屬(Fusobacterium)的豐度增加,顫螺旋菌屬(Helicobacter)、糞球菌屬(Coprococcus)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的豐度減少(P均<0.05);與PCOS組比較,BBR組普氏菌屬(Prevotell)、韋永氏球菌屬(Veillonella)、孿生球菌屬(Gemella)和梭形桿菌屬(Fusobacterium)的豐度降低,而布勞特氏菌屬(Blautia)、顫螺旋菌屬(Helicobacter)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、糞球菌屬(Coprococcus)、副桿菌屬(Parabacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、羅氏菌屬(Roseburia)、酪酸菌屬(Butyricicoccus)、鏈球菌屬(strecoccus)和帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)等有益菌屬的豐度均增加(P均<0.05)。前15位有豐度差異的屬水平菌群見圖2。

圖2 4組小鼠屬水平腸道菌群豐度比較

2.2 各組小鼠體質量比較 正常對照組、PCOS組、達英-35組和BBR組小鼠末次給藥時體質量分別為(16.23±0.87) g、(22.76±3.23)g、(18.45±0.96)g和(17.88±0.43)g。與正常對照組小鼠比較,PCOS組小鼠體質量增加(t/P=4.782/0.013);與PCOS組比較,達英-35組和BBR組小鼠體質量明顯降低(t/P=3.133/0.011,3.668/0.004)。

2.3 各組小鼠發情周期比較 小鼠月經周期呈現動情前期(P)、動情期(E)、動情間期(M)和動情后期(D),4～5 d為1個性周期且規律出現;陰道涂片細胞學分析發現,正常對照組小鼠月經周期正常,PCOS組小鼠D期延長,提示無排卵;達英-35組和BBR組小鼠發情周期在治療后逐漸恢復規律,見圖3。

注:P.動情前期;E.動情期;M.動情間期;D.動情后期。

2.4 各組小鼠血清性激素水平比較 與正常對照組比較,PCOS組小鼠血清T、LH和LH/FSH水平升高,E2和FSH水平降低(t/P=4.626/0.001,5.703/<0.001,2.578/0.028,2.847/0.017,3.079/0.012)。與PCOS組比較,達英-35組小鼠血清T、LH和LH/FSH水平降低,E2和FSH水平升高(t/P=3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.389/0.038,3.354/0.007),BBR組血清T、LH和LH/FSH水平亦降低(t/P=4.602/0.001,6.101/<0.001,2.535/0.030),但PCOS組和BBR組E2和FSH水平比較差異無統計學意義(t/P=1.031/0.327,1.623/0.136),見表2。

表2 各組小鼠血清性激素水平比較

2.5 各組小鼠胰島素代謝相關指標水平比較 與正常對照組比較,PCOS組小鼠FPG、FINS和HOMA-IR水平升高,ISI降低(t/P=4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/<0.001,3.541/0.005);與PCOS組比較,BBR組FPG、FINS和HOMA-IR水平明顯下調,ISI上調(t/P=5.950/<0.001,2.914/0.015,7.630/<0.001,3.198/0.010);達英-35組和PCOS組比較,FINS和HOMA-IR水平亦降低,ISI升高(t/P=2.908/0.016,6.096/<0.001,3.194/0.010),而FPG差異無統計學意義(t/P=0.906/0.386),見表3。

表3 各組小鼠胰島素代謝水平比較

2.6 各組小鼠卵巢組織病理形態比較 HE染色結果顯示,與正常對照組比較,PCOS組小鼠的卵巢形態發生了改變,卵巢皮質增厚,結構不均勻,無黃體或黃體數量極少,囊性卵泡體積增大,卵巢呈典型的多囊性改變,原始卵泡和初級卵泡數量明顯減少。與PCOS組比較,達英-35組鏡下可見卵巢皮質層略有變薄,黃體數量增多,卵泡體積變小;BBR組小鼠卵巢皮質層顯著變薄,黃體數量明顯增多,卵泡形態完整,排列整齊,見圖4。

注:黑色箭頭所示為卵泡,紅色箭頭所示為黃體。

2.7 各組小鼠結腸組織Claudin-1和Occludin表達水平比較 免疫組化結果顯示,與正常對照組比較,PCOS組小鼠結腸組織Claudin-1和Occludin蛋白水平下降(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004);與PCOS組比較,達英-35組和BBR組小鼠結腸組織Claudin-1和Occludin表達均升高(t/P=2.390/0.038,2.247/0.048;3.799/0.003,3.185/0.010),見表4。

表4 各組小鼠結腸組織Claudin-1、Occludin表達水平比較

2.8 各組小鼠卵巢組織PI3K/AKT相關蛋白表達比較 與正常對照組比較,PCOS組小鼠卵巢組織p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(t/P=13.474/<0.001,17.285/<0.001);與PCOS組比較,達英-35組和BBR組小鼠卵巢組織p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(t/P=7.323/<0.001,7.564/<0.001;7.473/<0.001,8.187/<0.001),見表5。

表5 各組小鼠結腸組織PI3K/AKT通路相關蛋白表達比較

3 討 論

PCOS是育齡婦女常見的內分泌紊亂性疾病,患者面臨排卵障礙引起的不孕癥等疾病的更高風險[1]。目前西醫治療PCOS的藥物長期使用效果不佳,甚至會產生諸多不良反應。開發既能有效治療PCOS且不良反應小的藥物,并探索其作用機制,已成為當今PCOS研究的重要方向和熱點。

根據PCOS臨床及病理特征,Kafali等[9]首創的利用非甾體類芳香化酶抑制劑來曲唑構建雌鼠PCOS模型,是目前公認的、較為全面的、能夠反映PCOS臨床患者內分泌狀態和卵巢病理改變的良好動物模型,表現出無排卵、性激素紊亂、體質量增加和胰島素抵抗(IR)等一系列代謝特征。高雄激素血癥是PCOS的重要病理特征之一,T水平受P450芳香化酶的影響,較高雄激素可引起PCOS卵泡發育異常,卵泡壁無法破裂,導致卵泡閉鎖和排卵障礙[10]。此外,高雄激素血癥會誘導前卵泡堆積,FSH減少和功能下降。依賴FSH的P450芳香化酶合成受到抑制,卵巢T向E2的轉化減慢,導致高T低E2。同時,高LH/FSH比率被認為是PCOS的診斷標志,提高FSH水平可促進卵泡生長[11]。因此,本研究利用來曲唑誘導PCOS小鼠模型,結果發現,PCOS小鼠表現出體質量逐漸下降,性激素代謝紊亂,卵巢呈典型的多囊性改變,提示模型構建成功。

BBR是中草藥黃連、黃柏和小檗皮的主要活性成分,已被用于治療腹瀉、代謝紊亂和不孕癥。最近證據表明BBR有望治療PCOS,Mishra等[12]研究發現,BBR對臨床癥狀、激素水平和血脂參數方面的調節作用比二甲雙胍更有效,可有效降低PCOS患者的心血管疾病風險。動物實驗研究亦顯示,BBR可通過抑制炎性反應和細胞凋亡對PCOS大鼠發揮保護作用,促進PCOS大鼠排卵,改善其代謝紊亂和子宮內膜容受性[13]。本研究評估了BBR對PCOS小鼠生殖和代謝特征的影響,發現BBR不僅能顯著緩解卵巢結構和功能障礙,還能通過調節血清性激素和胰島素代謝發揮保護作用,這與以往的文獻結果相一致[13],表明BBR可能在PCOS的治療中發揮重要作用,但其調節血清激素水平和代謝異常的機制仍不清楚。

近年來大量研究表明,腸道菌群在人類多種疾病的發生、發展中發揮重要作用,提出了通過干預腸道菌群以防治疾病新的臨床策略。由于PCOS患者高水平的循環胰島素刺激卵巢細胞產生過量雄激素已得到體內和體外研究的支持,一種關于PCOS發展的微生物學假說認為,腸道菌群失調可促進卵巢產生雄激素,引發慢性炎性反應和IR干擾卵泡正常發育[14]。多個臨床研究發現,與正常者比較,PCOS女性腸道菌群α多樣性降低,而且PCOS高雄激素血癥與腸道菌群α多樣性呈負相關[15]。Li等[16]將PCOS小鼠糞便菌群移植到無菌小鼠中,發現腸道菌群與其宿主的性激素水平、發情周期和卵巢形態變化密切相關。因此,通過對腸道菌群的檢測和靶向治療,可能對PCOS的預測和療效有一定的指導意義。本研究通過16S rDNA基因測序發現,PCOS小鼠腸道菌群發生了整體改變,且BBR治療可顯著改善PCOS小鼠腸道菌群α和β多樣性。嚙齒類動物和人類的腸道菌群門水平十分相似,均以厚壁菌門和擬桿菌門為主(約占80%)[17],與本結果類似。Torres等[18]發現,來曲唑誘導小鼠腸道菌群中多類菌屬平均相對豐度發生顯著變化,而BBR治療可使這些菌屬豐度降低。這些結果提示,PCOS小鼠存在腸道菌群失調,而BBR治療可能通過調整小鼠腸道菌群組成和結構影響激素水平,從而改善PCOS。

腸道屏障功能受損往往是PCOS發病機制中一個重要的加重因素[19],上調腸黏膜中Claudin-1和Occludin的表達可減少腸黏膜損傷,為預防腸屏障功能障礙提供了新的方向。本研究發現,BBR干預后,結腸組織中Claudin-1和Occludin的表達明顯增加,糞球菌屬、顫螺旋菌屬和羅氏菌屬豐度上調。研究發現這些細菌可通過抑制TLR-NF-κB通路減輕炎性反應,有助于調節腸道平衡,維持腸道屏障功能,促進受損組織的修復和再生[20]。此外,補充BBR后,鏈球菌、布勞特氏菌和乳酸菌等產生短鏈脂肪酸(SCFA)的菌屬有所增加,可為上皮細胞提供能量,增加緊密連接蛋白表達,促進有益菌生長[7]。研究表明,羅氏菌屬和顫螺旋菌屬可參與產生丁酸鹽和丁酸鹽樣物質,以保護腸道屏障功能的完整性[21]。這些結果提示,BBR通過影響腸道菌群的組成或產生SCFA、丁酸鹽和丁酸鹽樣物質來改善腸道屏障功能。

IR是PCOS的典型特征,其中經典的PI3K/AKT信號通路通過促進葡萄糖轉運并抑制糖元合成來調節代謝。Alaaeldin等[22]通過建立IR體外模型證實,IR與PI3K/AKT信號通路有關,胰島素受體激活后,誘導胰島素受體底物(IRS)磷酸化,與PI3K蛋白結合,調節細胞的葡萄糖攝入量。與此結果一致, BBR治療后,PCOS小鼠血清FPG、FINS和HOMA-IR水平顯著下降,卵巢組織PI3K/AKT通路磷酸化明顯增多。此外,PI3K/AKT在維持腸道屏障功能方面發揮著重要作用,如在缺氧時調節Occludin和Claudin-1的表達,以及刺激腸道干細胞在腸道中的擴增[23]。因此,經BBR干預后,Claudin-1和Occludin顯著下調,PCOS的病理狀態得到改善。

綜上所述,BBR可能通過調節腸道菌群并激活PI3K/AKT信號通路,降低PCOS小鼠體質量和胰島素抵抗,改善激素水平,減輕卵巢功能障礙,增強腸道通透性和腸道屏障功能。然而,BBR如何影響PCOS小鼠腸道菌群的確切機制還需要進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊宇琦:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;吳麗娜:提出研究方向,論文審核;孫克:實施研究過程,資料搜集整理;邢偉園:進行統計學分析;侯越:實施研究過程,數據收集、分析整理;張麗文:實施研究過程,論文修改