蘿卜硫素通過(guò)調(diào)節(jié)ALOX5/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞糖酵解抑制糖尿病腎病進(jìn)展

烏日娜,丁海東,常 宏,孫娜娜,張 磊

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥[1]。有文獻(xiàn)[2]報(bào)道,在DN中高糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解并且加速DN進(jìn)展。蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是一種主要從西蘭花等十字花科蔬菜中提取的異硫氰酸鹽,Kong et al[3]研究表明,SFN可以減輕糖尿病腎纖維化。花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)基因在人體中起著重要作用,其編碼的蛋白質(zhì)是一種催化花生四烯酸等多不飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)的雙加氧酶[4]。研究[5]表明,ALOX5在高糖誘導(dǎo)的體外DN細(xì)胞模型中表達(dá)上調(diào),敲低ALOX5通過(guò)抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)高糖處理的腎系膜細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。此外,也有研究[6]表明SFN能夠抑制NF-κB通路的激活。然而,關(guān)于SFN調(diào)控ALOX5/NF-κB信號(hào)通路在DN中的作用機(jī)制尚不明確。該研究旨在探討SFN通過(guò)調(diào)節(jié)ALOX5/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞糖酵解對(duì)DN進(jìn)展影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器雄性C57BL/6小鼠[許可證號(hào):SCXK(蒙)2020-0001]購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2細(xì)胞)和人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1細(xì)胞)(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),貨號(hào):GNHu47、TCHu57);SFN(上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司,貨號(hào):4478-93-7);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(上海懋康生物科技有限公司,貨號(hào):18883-66-4);Lipofectamin3000試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)ThermoFisher公司,貨號(hào):L3000015、11875119);CCK-8溶液、佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)、Triton X-100(美國(guó)MedChemExpress公司,貨號(hào):HY-K0301、16561-29-8、HY-Y1883A );Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室(美國(guó)康寧公司,貨號(hào):3412);原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)試劑盒(瑞士Roche公司,貨號(hào):11684817910);葡萄糖和乳酸試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司,貨號(hào):KA4088、K607-100);小鼠CD11b磁珠(北京諾為生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):AM0111210);RIPA裂解液、BCA試劑盒、10%SDS-PAGE、ECL(上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司,貨號(hào):P0013B、ST2222、P0690、P0018S);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司,貨號(hào):IPVH00010);一抗:抗己糖激酶-2(hexokinase-2,HK2)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、ALOX5、NF-κB、p-NF-κB和β-actin,二抗:辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab209847、ab85555、ab115730、ab169755、ab239882、ab264271、ab8227);Masson染色試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司,貨號(hào):BP-DL022); ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號(hào):ml037585);細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司,型號(hào):CellXpert? C170i);自動(dòng)生化分析儀(日本東京日立公司,型號(hào):7600);酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司,型號(hào):DNM-9602A);光學(xué)顯微鏡(日本OLUMPUS公司,型號(hào):IX53);熒光顯微鏡(日本Nikon公司,型號(hào):SMZ18)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 通過(guò)Swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得SFN的靶基因,之后借助GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找DN相關(guān)芯片GSE30122和GSE30529,以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因表達(dá)水平的對(duì)數(shù)倍數(shù)變化的絕對(duì)值大于1,校正后P<0.05為條件篩選DN相關(guān)基因,去除重復(fù)基因。借助Venn在線(xiàn)工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取SFN靶基因和DN相關(guān)基因的交集。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將HK-2細(xì)胞分為如下組:正常糖(NG)組、HG組、HG+SFN組、HG+ALOX5組、HG+SFN+ALOX5組。巨噬細(xì)胞和HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)組分為:NG處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組、HG處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組、HG+SFN處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組、HG+ALOX5轉(zhuǎn)染處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組、HG+SFN+ALOX5轉(zhuǎn)染處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組。

使用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞和THP-1細(xì)胞,并置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。為構(gòu)建體外DN模型,使用30 mmol/L高葡萄糖(high glucose,HG)處理HK-2細(xì)胞24 h誘導(dǎo)DN損傷模型,使用5.5 mmol/L正常葡萄糖(normal glucose,NG)處理HK-2細(xì)胞24 h作為對(duì)照組,將SFN溶解于DMSO中并稀釋至所需濃度3 mmol/L后處理HG組細(xì)胞24 h[7]。使用100 ng/ml PMA處理48 h誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,并使用上述方法處理巨噬細(xì)胞,評(píng)估SFN對(duì)HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解的影響。

使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)完成巨噬細(xì)胞和HK-2細(xì)胞的共培養(yǎng),首先在Transwell小室上腔加入HK-2細(xì)胞,之后在Transwell小室下腔添加不同條件處理后的巨噬細(xì)胞,在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將巨噬細(xì)胞接種于6孔板中(密度為1×105個(gè)/孔),待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合度時(shí),使用Lipofectamin3000試劑將ALOX5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并用于后續(xù)研究。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中,37 ℃孵育過(guò)夜直至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),之后將10 μl CCK-8溶液添加到96孔板中,繼續(xù)孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。

1.2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組HK-2細(xì)胞處理完畢后制備成細(xì)胞爬片,室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。PBS沖洗,用1%Triton X-100透化3 min。PBS洗滌3次,每次5 min,吸水紙吸干樣本周?chē)?每個(gè)樣本滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液,放入避光濕盒中,37 ℃反應(yīng)1 h。PBS再次洗滌,加入DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.2.6檢測(cè)葡萄糖和乳酸水平 收集各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基,以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min后取上清液,根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用葡萄糖和乳酸試劑盒檢測(cè)上清液中葡萄糖和乳酸的水平。

1.2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 18只雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠(8周齡)體質(zhì)量18～22 g用于本研究。將所有小鼠飼養(yǎng)在無(wú)特殊病原體的環(huán)境中,溫度22 ℃,濕度50%～55%,光照/黑暗12 h循環(huán)。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,將小鼠分為對(duì)照組(con組)、DN組、DN+SFN組。對(duì)照組給與正常飼料喂養(yǎng),DN和DN+SFN組給與高脂飲食,連續(xù)喂養(yǎng)4周后構(gòu)建DN小鼠模型,使用STZ(60 mg/kg,溶解在檸檬酸鈉中,pH 4.5)對(duì)DN和DN+SFN組小鼠行腹腔注射,每d 1次,注射連續(xù)5 d,對(duì)照組(con組)腹腔注射等量檸檬酸鈉溶液。最后一次注射5 d后,通過(guò)小鼠尾靜脈檢測(cè)小鼠空腹血糖,并留取24 h尿液,當(dāng)連續(xù)3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L且尿蛋白陽(yáng)性被認(rèn)為DN模型誘導(dǎo)成功。隨后DN+SFN組小鼠使用SFN(0.5 mg/kg)行皮下注射,每周5次,持續(xù)4個(gè)月[3]。

1.2.8生化分析 在治療結(jié)束前24 h,將動(dòng)物關(guān)在單獨(dú)的代謝籠中收集24 h尿液,用ELISA試劑盒檢測(cè)24 h尿蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,小鼠通過(guò)尾靜脈收集小鼠血液標(biāo)本,使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)量小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)的水平。

1.2.9腎組織中巨噬細(xì)胞分離 血液采集結(jié)束后使用50 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,之后以頸椎脫臼法安樂(lè)死小鼠,解剖后取腎組織。小鼠腎組織(100 mg)使用含膠原酶的培養(yǎng)基在37 ℃水浴中消化1 h,然后使用過(guò)濾網(wǎng)(40 μm)過(guò)濾。使用小鼠CD11b磁珠分離過(guò)濾液收獲巨噬細(xì)胞,用于后續(xù)Western blot分析。

1.2.10Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液提取各組HK-2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小鼠腎組織巨噬細(xì)胞中的總蛋白,使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度。每組30 μg蛋白在10%SDS-PAGE上進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h。然后與一抗:抗HK-2(1/1 000),PKM2(1/1 000),GLUT1(1/100 000),ALOX5(1/2 000),NF-κB(1/1 000),p-NF-κB(1/2 000)和β-actin(1/2 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜,TBST洗滌后,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗(1/1 000)在室溫下避光孵育2 h。ECL對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、成像,以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)灰度值。

1.2.11小鼠腎組織HE染色 小鼠腎組織脫水,10%福爾馬林固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,脫蠟,水化,常規(guī)HE染色后在顯微鏡下觀察腎組織的病理改變。

2 結(jié)果

2.1 SFN抑制ALOX5/NF-κB信號(hào)通路如圖1A,生物信息學(xué)分析顯示SFN的靶基因與DN相關(guān)基因的交集共8個(gè),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[5]選擇ALOX5進(jìn)行進(jìn)一步研究。Western blot 檢測(cè)HK-2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中ALOX5和NF-κB的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,與NG組相比,HG組巨噬細(xì)胞及HK-2細(xì)胞中ALOX5和p-NF-κB的表達(dá)均上調(diào)(q=20.05、22.54、19.79、21.06,均P<0.001)。與HG組相比,SFN處理后抑制了高糖處理HK-2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的ALOX5和p-NF-κB的表達(dá)(q=13.51、14.72、14.01、14.67,均P<0.001)。見(jiàn)圖1B、C。提示SFN處理能夠抑制HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和HK-2細(xì)胞中ALOX5和NF-κB通路相關(guān)因子的表達(dá)。

2.2 SFN抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷CCK-8檢測(cè)和TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,與NG組相比,HG組HK-2細(xì)胞活力百分?jǐn)?shù)下降,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞占比增多(q=13.44、16.96,均P<0.001)。與HG組相比,SFN處理后HK-2細(xì)胞活力增強(qiáng),細(xì)胞凋亡被抑制(q=7.523、9.435,均P<0.01)。見(jiàn)圖2。提示SFN能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。

圖2 SFN抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷

2.3 SFN抑制高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解與NG組相比,HG處理上調(diào)巨噬細(xì)胞上清液中葡萄糖水平和乳酸的水平(q=35.24、14.37,均P<0.001),而SFN處理后HG誘導(dǎo)的葡萄糖水平和乳酸的水平(q=10.31、8.974,P<0.001、P=0.002)被抑制。見(jiàn)圖3A、B。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,HG處理后HK2、PKM2和GLUT1的表達(dá)均高于NG組(q=14.10、11.59、14.39,均P<0.001),而SFN處理明顯降低HG誘導(dǎo)的HK2、PKM2和GLUT1的水平(q=9.574、7.472、9.595,均P<0.01)。見(jiàn)圖3C。

圖3 SFN抑制高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞糖酵解

2.4 SFN抑制高糖處理的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷將CCK-8和TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,與NG處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組相比,HG處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組細(xì)胞活力降低,細(xì)胞凋亡增加(q=17.11、17.32,均P<0.001);SFN處理后,HG處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞活力增強(qiáng),且細(xì)胞凋亡減少(q=13.64、10.40,均P<0.001)。見(jiàn)圖4。提示SFN能夠抑制高糖處理的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。

圖4 SFN抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷

2.5 過(guò)表達(dá)ALOX5減弱SFN對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用檢測(cè)結(jié)果顯示,與HG+SFN組相比,HG+SFN+ALOX5組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中葡萄糖水平和乳酸水平升高(q=4.950、5.739,P=0.033、0.0154),且細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達(dá)均上調(diào)(q=3.888、6.760、6.327,P=0.048、0.005、0.007)。提示ALOX5可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的糖酵解過(guò)程。此外,相比于HG+ALOX5組,SFN處理后,HG+SFN+ALOX5組巨噬細(xì)胞中的葡萄糖水平和乳酸水平降低(q=10.97、10.66,均P<0.001),糖酵解相關(guān)蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達(dá)降低(q=20.91、16.69、27.13,均P<0.001)。見(jiàn)圖5A-C。提示SFN可能抑制ALOX5促進(jìn)巨噬細(xì)胞的糖酵解這一過(guò)程。與HG+SFN處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組相比,

圖5 過(guò)表達(dá)ALOX5減弱SFN對(duì)巨噬細(xì)胞糖酵解引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

轉(zhuǎn)染ALOX5并且以HG+SFN處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組中的細(xì)胞活力降低,細(xì)胞凋亡增加(q=16.34、5.92,P<0.001、P=0.013)。與HG+ALOX5轉(zhuǎn)染處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組比較,HG+SFN+ALOX5轉(zhuǎn)染處理的巨噬細(xì)胞+HK-2細(xì)胞組中細(xì)胞活力增加、凋亡降低(q=10.08、8.68,均P<0.001)。見(jiàn)圖5D、E。說(shuō)明通過(guò)促進(jìn)ALOX5表達(dá)可能影響腎臟細(xì)胞的活力和凋亡水平,并且會(huì)影響SFN對(duì)腎臟細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.6 SFN減輕DN模型小鼠腎損傷并抑制腎臟巨噬細(xì)胞糖酵解本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖見(jiàn)圖6A。與con組比較,DN組小鼠FBG、24小時(shí)尿蛋白、BUN和Scr均上調(diào)(q=18.17、21.61、20.45、10.88,均P<0.001),糖酵解相關(guān)蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達(dá)均升高(q=17.92、15.50、15.09,均P<0.001)。使用SFN治療后,FBG、24小時(shí)尿蛋白、BUN和Scr水平均降低(q=9.265、8.538、9.830、7.183,均P<0.01),糖酵解相關(guān)蛋白HK2、PKM2和GLUT1表達(dá)均降低(q=11.88、10.44、10.06,均P<0.01)。見(jiàn)圖6B-E、G。HE染色結(jié)果顯示,con組腎小球體積和結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變,DN組腎小球基底膜增厚、系膜增生,細(xì)胞空泡變性增多,腎小球體積增大,而SFN治療后,這些病理改變和纖維化得到改善。見(jiàn)圖6E。提示SFN可能對(duì)DN具有治療作用。

圖6 SFN對(duì)DN模型小鼠腎損傷和腎臟巨噬細(xì)胞糖酵解影響

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,且多種因素,如血流動(dòng)力學(xué)異常、代謝紊亂和晚期糖基化終產(chǎn)物的形成均被認(rèn)為與DN的發(fā)病有關(guān)[8]。巨噬細(xì)胞是DN患者和動(dòng)物模型腎組織中浸潤(rùn)最豐富的免疫細(xì)胞類(lèi)型之一。高血糖、腎小球免疫復(fù)合物沉積和趨化因子的產(chǎn)生能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞在腎臟中的積累和活化,進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷和纖維化[9]。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道,DN小鼠腎臟巨噬細(xì)胞糖酵解增強(qiáng),通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞糖酵解可以減輕腎臟炎癥和纖維化。本研究表明SFN能夠抑制ALOX5和NF-κB的表達(dá)及巨噬細(xì)胞糖酵解介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷,且SFN有利于改善DN小鼠腎功能和組織損傷。

糖酵解是一種細(xì)胞代謝途徑,最近的研究[11]表明,M1巨噬細(xì)胞被促炎因子激活時(shí)會(huì)快速通過(guò)糖酵解獲取能量并促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Zeng et al[12]表明,HG可以誘導(dǎo)骨髓源性巨噬細(xì)胞分化為M1促炎表型,且在HG條件下M1巨噬細(xì)胞糖酵解增加。此外,糖酵解激活會(huì)進(jìn)一步上調(diào)巨噬細(xì)胞中促炎和纖維化基因的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果表明,HG處理后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中葡萄糖和乳酸的水平升高,糖酵解相關(guān)蛋白(HK2、PKM2、GLUT1)的表達(dá)上調(diào)。同時(shí),從DN小鼠腎臟分離的巨噬細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)高于正常對(duì)照組小鼠。這些結(jié)果表明,在高葡萄糖環(huán)境下或DN發(fā)展過(guò)程中,巨噬細(xì)胞的糖酵解途徑增加。這可能是由于糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致了葡萄糖的優(yōu)先代謝及乳酸的累積。而使用SFN處理巨噬細(xì)胞后,糖酵解途徑被抑制,可能是通過(guò)調(diào)控糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

關(guān)于DN的研究[14]顯示ALOX5在高葡萄糖處理的HK-2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),且ALOX5可能參與了DN患者中的鐵死亡分子機(jī)制,可能通過(guò)特定的代謝途徑和免疫/炎癥機(jī)制發(fā)揮作用。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子,有研究[15]報(bào)道NF-κB在DN中表達(dá)上調(diào),抑制其活化能夠減輕高糖處理對(duì)足細(xì)胞的促炎反應(yīng)和促凋亡作用。本研究證明了ALOX5是SFN治療DN的核心靶點(diǎn)。HG處理后的巨噬細(xì)胞和HK-2中ALOX5和p-NF-κB的蛋白表達(dá)上調(diào),而SFN處理則能夠抑制ALOX5和p-NF-κB的表達(dá)。本研究顯示過(guò)表達(dá)ALOX5能夠增強(qiáng)HG條件下巨噬細(xì)胞糖酵解以及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷,減弱SFN對(duì)HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了ALOX5在糖尿病性腎病中的重要作用,并且提示SFN可能通過(guò)抑制ALOX5和p-NF-κB表達(dá),調(diào)節(jié)糖酵解和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的損傷來(lái)發(fā)揮其治療DN的作用。

綜上所述,SFN通過(guò)抑制ALOX5/NF-κB通路激活來(lái)抑制巨噬細(xì)胞糖酵解從而改善DN的進(jìn)展。ALOX5可以作為治療DN的潛力靶點(diǎn)。本研究為DN的治療提供了新的方向和思路。然而本研究也存在一定局限性,如本研究只關(guān)注了ALOX5和NF-κB通路,未完全探究其他可能的機(jī)制和靶點(diǎn),可能有其他未知的關(guān)鍵因素在DN的發(fā)展中起到了重要作用。此外,本研究并未對(duì)SFN的藥理學(xué)或毒理學(xué)進(jìn)行深入研究。未來(lái)有待進(jìn)一步研究ALOX5和NF-κB通路參與DN進(jìn)展的機(jī)制以及SFN的藥理作用。