環(huán)狀RNA_PLEKHM3通過miR-320/KLF4軸調(diào)控宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

張亞男,崔 瑩,王天嬌,杜忠蕾

宮頸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制十分復(fù)雜,其中包括多種與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的突變和細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[1],闡明宮頸癌細(xì)胞EMT的內(nèi)在分子機(jī)制對(duì)宮頸癌的治療具有重要價(jià)值。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種具有共價(jià)閉環(huán)的非編碼RNA,不受RNA外切酶的影響,因此circRNA的表達(dá)穩(wěn)定,不易被降解[2]。研究[3]表明,circRNA在宮頸細(xì)胞中可能扮演腫瘤激活因子或抑制因子。circRNA的主要機(jī)制是通過作為一種分子海綿來調(diào)控微小RNA(microRNA,miRNA)的表達(dá)和功能,其作為一種分子支架調(diào)控miRNA與靶蛋白相互作用,從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。研究[5]表明circRNA-含Pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域家族M成員3(Pleckstrin homology domain-containing family M member 3,PLEKHM3)具有抑制癌癥的潛力,可以扮演抑癌基因的角色,如circRNA_PLEKHM3過表達(dá)可以起到增強(qiáng)姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抗凋亡作用以及對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用。但circRNA_PLEKHM3在宮頸癌中的作用尚不清楚。該研究旨在從細(xì)胞水平闡明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌EMT中的作用機(jī)制,為宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器circRNA_PLEKHM3過表達(dá)載體(pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3,circRNA_PLEKHM3)(貨號(hào):C01001)、空載體Vector(貨號(hào):C01001)、miR-320的模擬物(miR-320 mimics)(貨號(hào):C09001)、miR-320的模擬物的陰性對(duì)照(mimics NC)(貨號(hào):C09001)、miR-320的抑制劑(miR-320 inhibitor)(貨號(hào):C09004)、miR-320的抑制劑的陰性對(duì)照(inhibitor NC)(貨號(hào):C09004),小干擾RNA(siRNA)沉默畸變樣因子4(kruppel-like factor 4,KLF4)的重組質(zhì)粒(si-KLF4)(貨號(hào):G04003)、si-KLF4的陰性對(duì)照(si-NC)(貨號(hào):G04003)、含circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突變型(circRNA_PLEKHM3-MUT)結(jié)合位點(diǎn)DNA片段的重組質(zhì)粒(貨號(hào):G05002)、含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)或突變型(KLF4 3’UTR MUT)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段的重組質(zhì)粒(貨號(hào):G05002)(上海吉瑪公司)。雙熒光素酶試劑盒(美國(guó)promega公司,貨號(hào):E1910)。人宮頸鱗狀細(xì)胞系Hela(貨號(hào):Delf-10469)和人宮頸癌上皮細(xì)胞系CaSki(貨號(hào):Delf-10473)(美國(guó)ATCC公司),人體正常上皮細(xì)胞系HaCat(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):T25)。KLF4激活劑APTO-253(美國(guó)MCE公司,貨號(hào):HY-16291)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(貨號(hào):A5669701)、杜氏改良培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基(貨號(hào):12491015)(美國(guó)Gibco公司)。兔抗KLF4(貨號(hào):ab222235)、上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)(貨號(hào):ab40772)、神經(jīng)鈣黏蛋白(neural cadherin,N-cadherin)(貨號(hào):ab245117)、波形蛋白(Vimentin)(貨號(hào):ab92547)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2(貨號(hào):ab92536)、MMP-9(貨號(hào):ab76003)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(貨號(hào):ab181603)的一抗及辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):ab205718)(英國(guó)Abcam公司)。生理鹽水(saline)(貨號(hào):ST341)、結(jié)晶紫染色液(貨號(hào):C0121)、Lipofectamine ?3000轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號(hào):C0526FT)、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):P0009)、RIPA裂解緩沖液(貨號(hào):P0013B)、免疫熒光原位雜交試劑盒(貨號(hào):R0306S)、FITC標(biāo)記的circRNA_PLEKHM3探針設(shè)計(jì)與合成(貨號(hào):R0306S)(上海碧云天生物科技有限公司)。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的抗小鼠二抗(貨號(hào):ZF-0312)、FITC 標(biāo)記的抗兔二抗(貨號(hào):ZB-2301)(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。Transwell小室(美國(guó)SigmaAldrich公司,貨號(hào):32011202)。二脒基苯基吲哚(diaminidine phenyl indole,DAPI)(北京Solaribo公司,貨號(hào):28718-90-3)。pMIR-GLO熒光素酶載體(德國(guó)Promega公司,貨號(hào):E1330)。熒光顯微鏡(德國(guó)蔡司公司,型號(hào):Axio Imager A2);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):CFX96)、Western blot成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):CFX96);(美國(guó)伯樂公司,型號(hào):ChemiDoc)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)分組和轉(zhuǎn)染 Hela、CaSki、HaCat細(xì)胞分別用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于37 ℃、含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。CaSki細(xì)胞的分組和轉(zhuǎn)染:分別將circRNA_PLEKHM3過表達(dá)載體pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3(circRNA_PLEKHM3組)、空載體Vector(Vector組)轉(zhuǎn)染至CaSki細(xì)胞,24 h后通過qRT-PCR檢測(cè)CaSki細(xì)胞PLEKHM3 mRNA表達(dá)以檢測(cè)細(xì)胞過表達(dá)circRNA_PLEKHM3的效果;分別將mimics NC(mimics NC組)、miR-320 mimics(miR-320 mimics組)以及inhibitor NC(inhibitor NC組)和miR-320 inhibitor(miR-320 inhibitor組)轉(zhuǎn)染至CaSki細(xì)胞,24 h后通過qRT-PCR法檢測(cè)miR-320表達(dá);此外,在轉(zhuǎn)染circRNA_PLEKHM3的同時(shí)分別將mimics NC(circRNA_PLEKHM3+mimics NC組)和miR-320 mimics(circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics組)轉(zhuǎn)染至CaSki細(xì)胞,孵育24 h。在轉(zhuǎn)染circRNA_PLEKHM3的同時(shí)分別將si-NC(circRNA_PLEKHM3+si-NC組)和si-KLF4(circRNA_PLEKHM3+ si-KLF4組)轉(zhuǎn)染至CaSki細(xì)胞,孵育24 h。在轉(zhuǎn)染miR-320 mimics的同時(shí)分別加入aline(mimics+saline組)和APTO-253(miR-320 mimics+APTO-253組)處理CaSki細(xì)胞,孵育24 h。

1.2.2原位熒光雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circRNA_PLEKHM3在Hela、HaCat和CaSki細(xì)胞中的分布 將正常培養(yǎng)且無處理的Hela、HaCat和細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中,與含有circRNA_PLEKHM3探針的雜交緩沖液在37 ℃暗處雜交過夜。用DAPI染細(xì)胞核。用熒光顯微鏡獲取圖像。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)circRNA_PLEKHM3、KLF4 mRNA和miR-320的表達(dá) 收集HaCat、Hela和CaSki細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△CT法計(jì)算circRNA_PLEKHM3、miR-320、KLF4mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-320和circRNA_PLEKHM3以及miR-320和KLF4的靶向關(guān)系 通過三個(gè)生物信息公共數(shù)據(jù)庫,starbase(star-base.sysu.edu.cn/)、target scan(targetscan.org/vert_70/)和circBase (http://www.circbase.org/)篩選出與circRNA_PLEKHM3有可能有相互作用的miRNA;同時(shí)在癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)(portal.gdc.cancer.gov)和ENCORI pan-cancer (https://rnasysu.com/encori/panCancer.php)數(shù)據(jù)庫中選擇在宮頸癌表達(dá)前100的miRNA,取miRNA的交集,篩選出circRNA_PLEKHM3可能的下游靶標(biāo)是miR-320。

為檢測(cè)miR-320和circRNA_PLEKHM3的靶向調(diào)控作用,本研究合成了含有circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突變型(circRNA_PLEKHM3-MUT)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段,并將其克隆到pMIR-GLO熒光素酶載體。分離重組質(zhì)粒并測(cè)序。分別將mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書使用Lipofectamine?3000與circRNA_PLEKHM3-WT/circRNA_PLEKHM3-MUT片段共轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 h后,更換培養(yǎng)基,將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,廢棄培養(yǎng)基,PBS洗滌細(xì)胞3次。用雙熒光素酶試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值作為熒光素酶活性。另外,本研究還合成含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)和突變型(KLF4 3’UTR MUT)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段,并將其克隆到pMIR-GLO熒光素酶載體。分離重組質(zhì)粒并測(cè)序。分別將mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書與KLF4 3’UTR WT/KLF4 3’UTR MUT片段共轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞,以檢測(cè)miR-320和KLF4的結(jié)合作用,其余方法與circRNA_PLEKHM3一致。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 用RIPA裂解緩沖液從各組細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì),采用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白:70 V、30 min轉(zhuǎn)120 V、90 min,將蛋白條帶以 300 mA 轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉 2 h,將膜與一抗在 4 ℃ 下孵育過夜:KLF4(1∶800)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶600)、Vimentin(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶500)、GAPDH(1∶3 000),隨后將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔 IgG (1∶2 000) 于室溫下一起孵育 1 h。用 ECL 檢測(cè)試劑顯示蛋白條帶,并采用 ImageJ 軟件分析每個(gè)條帶的灰度值。

1.2.6Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中預(yù)先在上室膜(膜的孔徑為8 μm)上涂基質(zhì)膠,將各組的細(xì)胞(5×104個(gè)/組)懸浮在無血清培養(yǎng)基的Transwell上室中,下室充滿20%含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,37 ℃下孵育48 h后,將上表面的剩余細(xì)胞去除,固定膜下表面上的細(xì)胞,然后用結(jié)晶紫染色,并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù),從而測(cè)定細(xì)胞侵襲情況。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,上室膜不涂基質(zhì)膠,其余步驟與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)一致。

2 結(jié)果

2.1 circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細(xì)胞中的定位和表達(dá)經(jīng)FISH染色觀察到circRNA_PLEKHM3和細(xì)胞核分別為綠色和藍(lán)色,circRNA_PLEKHM3定位于CaSki細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1A)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與HaCat細(xì)胞相比,circRNA_PLEKHM3在Hela細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中的表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.254、21.842,均P<0.05)(圖1B)。

圖1 circRNA_PLEKHM3在HaCat、CaSki和Hela細(xì)胞中表達(dá)的比較

2.2 CaSki細(xì)胞中circRNA_PLEKHM3對(duì)miR-320和KLF4表達(dá)的影響以及circRNA_PLEKHM3對(duì)miR-320的靶向調(diào)控qRT-PCR檢測(cè)顯示,與HaCat細(xì)胞相比,在CaSki細(xì)胞中miR-320的mRNA表達(dá)上調(diào)(t= 118.589,P<0.05),而KLF4中的mRNA表達(dá)下調(diào)(t=35.549,P<0.05)。見圖2A-B。CaSki細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)circRNA_PLEKHM3的載體,與Vector組比,circRNA_PLEKHM3組的circRNA_PLEKHM3上調(diào)(t=141.362,P<0.05),miR-320的表達(dá)下調(diào)(t=23.514,P<0.05),KLF4蛋白表達(dá)上調(diào)(t=37.498,P<0.05)。見圖2C-D。提示在CaSki細(xì)胞中過表達(dá)circRNA_PLEKHM3可以抑制miR-320的表達(dá),促進(jìn)KLF4蛋白的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,在circRNA_PLEKHM3-WT轉(zhuǎn)染的CaSki細(xì)胞中,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的熒光素酶活性下降(t=16.558,P<0.05),與inhibitor NC組比,inhibitor組的熒光素酶活性上調(diào)(t= 21.577,P<0.05)。而在circRNA_PLEKHM3-MUT轉(zhuǎn)染的CaSki細(xì)胞中,各組之間熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2E。提示miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶點(diǎn),circRNA_PLEKHM3可通過靶向調(diào)控miR-320抑制miR-320的表達(dá)。

圖2 CaSki細(xì)胞中circRNA_PLEKHM3對(duì)miR-320和KLF4表達(dá)的影響以及circRNA_PLEKHM3對(duì)miR-320的靶向調(diào)控

2.3miR-320靶向調(diào)控KLF4并抑制KLF4的表達(dá)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-320是否靶向調(diào)控KLF4。結(jié)果顯示,在KLF4 3’UTR-WT轉(zhuǎn)染的CaSki細(xì)胞中,與mimics NC組比,miR-320 mimics組熒光素酶活性下降(t=23.063,P<0.05),與inhibitor NC組比,inhibitor組的熒光素酶活性上調(diào)(t= 17.364,P<0.05)。而在KLF4 3’UTR-MUT轉(zhuǎn)染的CaSki細(xì)胞中,各組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3A。說明miR-320能夠靶向調(diào)控KLF4。此外,qRCT和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的miR-320的mRNA表達(dá)上調(diào)(t=18.639,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)下降(t=16.603、21.558,均P<0.05);與inhibitor NC組比,miR-320 inhibitor組的miR-320的mRNA表達(dá)下調(diào)(t=14.557,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)升高(t=21.512、17.611,均P<0.05)。見圖3B-D。提示CaSki細(xì)胞中miR-320能夠通過靶向調(diào)控KLF4并抑制KLF4的表達(dá)。

圖3 miR-320靶向調(diào)控KLF4并抑制KLF4的表達(dá)

2.4 過表達(dá)circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMTTranswell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Vector組比較,circRNA_PLEKHM3組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均下降(t=16.554、18.204,均P<0.05)。見圖4A-C。提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá),結(jié)果顯示,與Vector組比較,circRNA_PLEKHM3組的E-cadherin的表達(dá)增加(t=20.714,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均降低(t=15.603、24.880、18.562、14.069,均P<0.05)。見圖4C-H。以上結(jié)果提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT。

圖4 過表達(dá)circRNA_PLEKHM3對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT標(biāo)志物的影響

2.5過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMTTranswell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與circRNA_PLEKHM3+mimics NC組比較,circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均上調(diào)(t=18.602、15.266,均P<0.05)。見圖5A-C。提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá),結(jié)果顯示,與circRNA_PLEKHM3+mimics NC組比較,circRNA_PLEKHM3+

圖5 過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT標(biāo)志物的影響

miR-320 mimics組的E-cadherin的表達(dá)減少(t=24.187,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均增加(t=17.629、11.984、16.332、19.045,均P<0.05)。見圖5D-I。提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT。

2.6 過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過上調(diào)KLF4抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMTTranswell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與circRNA_PLEKHM3+si-NC組比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均上調(diào)(t=23.252、14.936;均P<0.05)。見圖6A-C。提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過上調(diào)KLF4抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá),結(jié)果顯示,與circRNA_PLEKHM3+si-NC組比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4組的E-cadherin的表達(dá)減少(t=15.423,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均增加(t=18.409、15.663、21.087、16.052,均P<0.05)。見圖6D-I。提示過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過上調(diào)KLF4抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT。

圖6 過表達(dá)circRNA_PLEKHM3通過上調(diào)KLF4對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT標(biāo)志物的影響

2.7 過表達(dá)miR-320通過抑制KLF4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMTTranswell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均上升(t=19.677、16.375,均P<0.05),與miR-320 mimics+saline組比,miR-320 mimics+APTO-253組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均下調(diào)(t=21.065、24.316,均P<0.05)。見圖7A-C。提示激活KLF4可以削弱miR-320 mimics對(duì)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲的促進(jìn)作用。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與mimics NC組比,miR-320 mimics組的E-cadherin的表達(dá)減少(t=16.394,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均增加(t=18.662、25.213、21.809、15.364,均P<0.05);與miR-320 mimics+saline組比,miR-320 mimics+APTO-253組的E-cadherin的表達(dá)增加(t=14.801,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表達(dá)均降低(t=25.450、18.468、16.212、22.866,均P<0.05)。見圖7D-I。提示過表達(dá)miR-320通過抑制KLF4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT。

圖7 過表達(dá)miR-320通過抑制KLF4對(duì)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲、EMT的影響

3 討論

circRNA在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)作用越來越受到關(guān)注[6]。本研究表明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá),其定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),提示circRNA_PLEKHM3在宮頸癌的發(fā)展中可能扮演重要角色;同時(shí)發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)circRNA_PLEKHM3可抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和遷移,這些結(jié)果提示,宮頸癌中circRNA_PLEKHM3可能是一種關(guān)鍵的抑癌靶點(diǎn)。此外,本研究還驗(yàn)證了circRNA_PLEKHM3與miR-320之間的關(guān)系。過表達(dá)circRNA_PLEKHM3抑制了miR-320的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的數(shù)據(jù)表明,miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶點(diǎn),miR-320 mimics抑制過表達(dá)circRNA_PLEKHM3對(duì)CaSki細(xì)胞遷移、侵襲以及EMT的抑制作用。

circRNA參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過程[7],也與宮頸癌密切相關(guān)[8]。本研究中,circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá),過表達(dá)circRNA_PLEKHM3后,宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均下降,提示circRNA_PLEKHM3具有抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移是宮頸癌預(yù)后不良的主要原因[9]。EMT是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟[9]。在EMT過程中,E-cadherin的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞連接被破壞,具有抑制癌細(xì)胞EMT、遷移和侵襲的作用,而N-cadherin的增加參與了EMT過程的發(fā)生,可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。E-cadherin和N-cadherin被報(bào)道[10]與惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究表明,過表達(dá)circRNA_PLEKHM3能夠降低N-cadherin的蛋白表達(dá)并增加E-cadherin的蛋白表達(dá),表明circRNA_PLEKHM3具有抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT、轉(zhuǎn)移和侵襲的潛力。此外,Vimentin、MMP-2和MMP-9等蛋白也是EMT過程的關(guān)鍵參與因子[11]。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)circRNA_PLEKHM3抑制了Vimentin、MMP-2和MMP-9的表達(dá),這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了circRNA_PLEKHM3在宮頸癌EMT調(diào)控中的重要性。

許多cicrRNA通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其調(diào)控功能。miR-320作為促癌miRNA分子,在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[5]。本研究表明miR-320是circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細(xì)胞中的靶分子,circRNA_PLEKHM3過表達(dá)明顯抑制了宮頸癌細(xì)胞中miR-320的表達(dá),細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也揭示了miR-320的模擬物逆轉(zhuǎn)了circRNA_PLEKHM3對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲、EMT的抑制作用,這就證明miR-320參與了circRNA_PLEKHM3對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的負(fù)調(diào)控作用。近年來發(fā)表的文章[5]支持了本研究結(jié)果,如在卵巢癌細(xì)胞中circRNA_PLEKHM3與miR-9或miR-320都具有靶向調(diào)節(jié)關(guān)系,circRNA_PLEKHM3可明顯抑制miR-9或miR-320的表達(dá),當(dāng)過表達(dá)miR-9或miR-320后,circRNA_PLEKHM3對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的調(diào)作用被逆轉(zhuǎn)。

miRNA通過靶向調(diào)控基因的表達(dá)來對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。之前的研究[5]顯示miR-320在卵巢癌中是促癌miRNA。本研究中的結(jié)果表明miR-320的靶基因是KLF4。作為一個(gè)關(guān)鍵抑癌基因,KLF4在多種腫瘤中的蛋白表達(dá)缺失,過表達(dá)KLF4表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤特征[12]。本研究進(jìn)一步觀察到miR-320 mimics可以抑制KLF4的表達(dá),而KLF4的激活劑APTO-253則抑制了miR-320 mimics對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT過程中的促進(jìn)作用。提示KLF4是miR-320的功能性下游靶基因。此外,本研究還證明circRNA_PLEKHM3過表達(dá)可以促進(jìn)KLF4的表達(dá),而沉默KLF4能夠明顯恢復(fù)細(xì)胞遷移、侵襲和EMT過程。由此可見,circRNA_PLEKHM3通過抑制miR-320的上調(diào)來抑制KLF4的表達(dá),從而調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過程。

綜上所述,本研究結(jié)果表明circRNA_PLEKHM3在宮頸癌細(xì)胞的EMT中具有抑制作用。通過調(diào)節(jié)miR-320的表達(dá),circRNA_PLEKHM3能夠?qū)LF4的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解和干預(yù)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲提供了重要的理論依據(jù),也為開發(fā)新的治療策略和靶向藥物提供了潛在的方向。然而,還需要更多的研究來深入探究circRNA_PLEKHM3、miR-320和KLF4之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以及它們?cè)趯m頸癌發(fā)生與發(fā)展中的具體作用機(jī)制。