內(nèi)皮素-1調(diào)控SOCC/TGF-β參與房顫大鼠發(fā)生心房纖維化

賈卓然,代曼玉,梁士楚,吳 健,薛楊誠,張定欣,沈 兵,趙 韌

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)是最常見的心律失常,我國成年人AF患病率為1.6%,較之前明顯升高[1]。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)引發(fā)并維持AF,目前認(rèn)為,心房纖維化是AF主要病理基礎(chǔ),但心房纖維化的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究缺乏,對于心房纖維化的有效干預(yù)靶點(diǎn)仍有待探究。內(nèi)皮素系統(tǒng)在維持心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要靶標(biāo)之一。大量研究[2-4]發(fā)現(xiàn),AF患者外周血和心房組織內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)含量升高,參與心房纖維化過程。鈣庫操縱性鈣內(nèi)流是鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要模式之一,對細(xì)胞分化、增殖、凋亡具有重要調(diào)控作用,其中,鈣感受器基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)、鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(calcium release-activated calcium channel protein 1,Orai1)是鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channels,SOCC)的主要功能蛋白。研究[5]表明ET-1通過介導(dǎo)胞外鈣離子內(nèi)流及胞內(nèi)鈣庫釋放調(diào)控胞漿鈣離子濃度,最近的研究[6]顯示,SOCC的激活參與ET-1在缺血再灌注過程中介導(dǎo)的冠脈收縮,但SOCC的激活是否參與AF心房纖維化過程及是否與ET-1調(diào)控相關(guān)尚不明確。該研究通過構(gòu)建AF大鼠模型及體外HL-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn),研究AF心房結(jié)構(gòu)變化及心房組織中ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β和COL-1蛋白表達(dá)情況,探究ET-1及SOCC在AF發(fā)生過程中的關(guān)聯(lián),并探討ET-1對AF心房纖維化的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)批號(hào):No.LLSC20190530),14只健康雄性成年Sprague-Dawlay (SD)大鼠來自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,體質(zhì)量220 g左右,組間體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,心率450次/分左右,竇性心律,依隨機(jī)數(shù)字原則分為對照(normal control,NC)組、房顫(atrial fibrillation,AF)組,統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲水,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室12 h/12 h明暗交替,濕度50%左右,溫度維持在 24 ℃左右并通風(fēng)良好。

1.1.2主要試劑和儀器 ET-1 (貨號(hào):HY-P71446)購自美國MedChemExpress公司; 乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)(貨號(hào):A6625)購自上海Sigma-Aldrich公司;氯化鈣(CaCl2)(貨號(hào):ST365)及BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào):P0010)購自上海碧云天生物科技有限公司;小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA) (貨號(hào):NS-028541)購自北京梓熙生物科技有限公司;Orai1 siRNA (si Orai1) 序列:sense (CCUCAACUCGGUCAAAGAG),antisense (CUCUUUGACCGAGUUGAGG);一抗 Anti-TGF-β (貨號(hào):BF 8012)、ET-1 antibody(貨號(hào):DF6125)、Anti-Orai1 (貨號(hào):DF 7956)、Anti-GAPDH (貨號(hào):AF 7021)、山羊抗小鼠二抗 (貨號(hào):S0002)及山羊抗兔二抗(貨號(hào):S0001)購自美國Affinity Biosciences公司;STIM1抗體(貨號(hào):GTX54855)購自美國 GeneTex公司; 一抗Anti-COL1 (貨號(hào):R 26615)購自ZENBIO Biosciences公司;一抗Anti-Tubulin (貨號(hào):10094-1)購自美國Proteintech Biosciences公司;HE染色試劑盒(貨號(hào):G 1120)及Masson三色染色試劑盒(貨號(hào):G 1340) 購自北京索萊寶生物科技有限公司;減血清培養(yǎng)基(opti-minimal essential medium,Opti-MEM)(貨號(hào):31985070)購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.US.。小鼠心房肌細(xì)胞HL-1細(xì)胞 (貨號(hào):FH1101)購自上海富衡生物科技有限公司。心臟超聲儀器購自美國General Electric HealthCare公司(型號(hào):Vivid E95 Ultra Edition);體式輔助顯微鏡(型號(hào):BX53F2)購自日本Olympus Corporation;二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào):HF90)購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠分組及AF模型構(gòu)建 將14只SD大鼠隨機(jī)分為NC組和AF組,每組7只。NC組大鼠10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥固定于鼠板上,四肢伸展用絕緣彈力帶牽拉固定,針形電極分別刺入四肢皮下,記錄正常心電圖。暴露大鼠尾靜脈,靜脈注射生理鹽水0.1 ml/100 g,每日尾靜脈注射1次,連續(xù)注射7 d,再次記錄心電圖;AF組大鼠同樣記錄正常心電圖后,暴露大鼠尾靜脈,靜脈注射CaCl2-Ach混合液0.1 ml/100 g(混合液濃度為CaCl210 mg/ml + Ach 66 ug/ml新鮮配制),每日尾靜脈注射1次,連續(xù)注射7 d,記錄心電圖,出現(xiàn)典型AF心電圖表現(xiàn)說明模型構(gòu)建成功(P波消失,代之以大小不等f波并持續(xù)時(shí)間>2 s)。

1.2.2超聲心動(dòng)圖 以50 mg/kg劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉全身麻醉兩組SD大鼠,膠帶固定大鼠四肢,使其背部朝下仰臥于鼠板上,充分暴露心臟所在位置,除去表皮毛發(fā),打開心臟超聲儀器,準(zhǔn)備完成后使用探頭(型號(hào):12 s)尋找大鼠心臟位置,M型頻譜掃描速度為200 mm/s,測定左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)及射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF),計(jì)算左室分?jǐn)?shù)縮短率(fractional shortening,FS)=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100%。采用模式追蹤法在胸骨旁長軸切面主動(dòng)脈竇水平測量左房內(nèi)徑(left atrium diameter,LAD),計(jì)算模型建立前后LAD、EF及FS的差值,并分別表示為ΔLAD、ΔEF及ΔFS。每項(xiàng)參數(shù)測量3次,計(jì)算平均值。

1.2.3心房組織HE染色和Masson染色 以50 mg/kg劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉全身麻醉兩組SD大鼠,無菌手術(shù)器械打開胸腔,取出心臟,無菌PBS液沖洗后,置于顯微鏡下分離出心房組織,固定脫水后制備石蠟切片。HE染色:將石蠟切片依次放入二甲苯醇Ⅰ浸泡10 min,無水二甲苯醇Ⅱ浸泡約10 min,無水二甲苯醇Ⅲ浸泡10 min 后用無水乙醇Ⅰ浸泡5 min,無水乙醇Ⅱ浸泡5 min后,依次按照由高到低濃度梯度乙醇溶液浸泡20 min,用蘇木精液染液處理5 min后水洗1 min,復(fù)用0.5%的鹽酸乙醇分化液處理30 s,水洗1 min 后用碳酸鋰藍(lán)化處理30 s,水洗2 min,加伊紅液染色處理3 s,流水沖洗1 min,依次按照由高到低濃度梯度的乙醇脫水后二甲苯?jīng)_洗使組織透明,滴加中性樹膠,蓋玻片封片,顯微鏡下觀察。根據(jù)Masson染色試劑盒說明進(jìn)行Masson染色。PBS緩沖液清洗切片3次,每次10 min,滴加鐵蘇木精染色液4 min后水洗,酸性乙醇溶液分化10 s,Masson藍(lán)化液染色3 min,再次水洗1 min,麗春品紅液染色1 s,弱酸水沖洗1 min,磷鉬酸溶液分色2 min,苯胺藍(lán)染液染色1 min,乙醇脫水后二甲苯?jīng)_洗使組織透明,滴加中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.2.4Western blot 法檢測心房組織ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β和COL-Ⅰ蛋白表達(dá) 取大鼠心房組織,加入適量裂解液,冰上研磨,4 ℃,12 000 r/min,離心20 min,取上清液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白含量,配平后行Western blot試驗(yàn),轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h,之后加入稀釋一抗ET-1 (1∶1 000),Orai1 (1∶1 000),STIM1 (1∶1 000),TGF-β(1∶1 000),COL-Ⅰ (1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后室溫孵育相應(yīng)稀釋二抗(1∶2 000)2 h,PBST洗膜后加入ECL顯影液顯影曝光。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值,檢測各組心房組織中ET-1、Orai1、STIM1、TGF-β、COL-Ⅰ的相對蛋白表達(dá)水平。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HL-1細(xì)胞,從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管,37 ℃水浴解凍,1 000 r/min 離心5 min 后,均勻接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,加入10%培養(yǎng)基約2 ml,于37 ℃恒溫,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代,第3代傳代至6孔板,細(xì)胞貼壁程度至正常70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA)的轉(zhuǎn)染,更換為Opti-MEM。將HL-1細(xì)胞分為4組:NC組(對照組)、ET-1組(ET-1處理)、Si Orai1組(Si Orai1轉(zhuǎn)染使Orai1表達(dá)降低)、ET-1+Si Orai1組(Si Orai1轉(zhuǎn)染使Orai1表達(dá)降低并使用ET-1處理)。以lipofectamine 3000為轉(zhuǎn)染試劑,Si Orai1組加入si Orai1溶液,轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L,置于37 ℃恒溫,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),6 h后更換新鮮10% DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行Orai1蛋白表達(dá)量檢測;ET-1組使用50 nmol/L的ET-1處理HL-1細(xì)胞24 h;ET-1+Si Orai1組即HL-1細(xì)胞在使用Si Orai1轉(zhuǎn)染48 h后,使用50 nmol/L的ET-1處理24 h ;對照組細(xì)胞不做處理,置入37 ℃恒溫,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.2.6Western blot法檢測細(xì)胞Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達(dá) 將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出,冰上操作,吸盡原培養(yǎng)基后加入細(xì)胞裂解液,搖床震蕩20 min充分裂解后轉(zhuǎn)至EP管,4 ℃高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量后行Western blot實(shí)驗(yàn),依次上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h,之后加入稀釋一抗Orai1 (1∶1 000),STIM1 (1∶1 000),TGF-β(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后加入相應(yīng)稀釋二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h后,均勻滴加顯影液后曝光。用ImageJ軟件分析條帶灰度值檢測蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 AF組與NC組大鼠心電圖與超聲心動(dòng)圖相關(guān)指標(biāo)的比較心電圖記錄結(jié)果顯示NC組大鼠呈竇性心律(圖1A),AF組大鼠可見典型AF心電圖表現(xiàn)(圖1B);大鼠超聲心動(dòng)圖數(shù)據(jù)顯示,與NC組大鼠相比(0.028±0.009) mm,AF組大鼠左房ΔLAD (0.119±0.013) mm增大(t=5.75,P<0.001),而ΔEF、ΔFS兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.70、2.49,均P>0.05)。見圖1C。

圖1 兩組大鼠心電圖及超聲心動(dòng)圖的比較

2.2 AF組大鼠心房組織病理變化情況SD大鼠心房組織HE及Masson染色結(jié)果顯示,NC組心房肌細(xì)胞排列整齊,形狀基本一致,AF組可見大片藍(lán)色膠原纖維沉積(圖2A),AF組大鼠心房組織纖維化增加(t=3.52,P<0.05)。見圖2B。

圖2 兩組大鼠心房組織纖維化情況的比較

2.3 AF組大鼠心房組織中ET-1、COL-1、Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達(dá)增多利用Western blot檢測心房組織中ET-1、纖維化相關(guān)蛋白COL-Ⅰ及TGF-β表達(dá)情況與SOCC功能蛋白Orai1、STIM1表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與NC組大鼠相比,AF組大鼠心房組織中ET-1、COL-1及TGF-β蛋白表達(dá)增多(t=2.92、5.19、2.45,均P<0.05),此外,AF組心房組織中Orai1、STIM1蛋白表達(dá)也增多(t=3.58、5.21,均P<0.01)。見圖3。提示AF大鼠在ET-1蛋白表達(dá)增多的同時(shí)發(fā)生心房纖維化。

圖3 兩組大鼠心房組織中ET-1、COL-1、Orai1、STIM1和TGF-β蛋白表達(dá)的比較

2.4 ET-1對HL-1細(xì)胞Orai1、STIM1、TGF-β表達(dá)情況影響Western blot檢測結(jié)果顯示,HL-1細(xì)胞接受濃度為50 nm/L的ET-1處理24 h后,Orai1、STIM1、TGF-β的表達(dá)上調(diào)(t=4.36、4.85、5.69,均P<0.05);當(dāng)細(xì)胞中SOCC功能蛋白Orai1表達(dá)敲減后,ET-1+Si Orai1組細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,然而,相較于ET-1組,其表達(dá)呈下調(diào)趨勢(圖4),提示ET-1促進(jìn)HL-1細(xì)胞TGF-β的表達(dá)過程中,SOCC功能蛋白參與其中。

圖4 ET-1對HL-1細(xì)胞Orai1、STIM1和TGF-β表達(dá)情況影響

3 討論

目前,心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)、異常鈣離子電流和自主神經(jīng)系統(tǒng)變化在AF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其中以心房纖維化為主要表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)重構(gòu)是AF發(fā)生和維持的關(guān)鍵[7]。許多途徑如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、氧化應(yīng)激和信息傳遞途徑能夠調(diào)節(jié)心房纖維化,TGF-β是其中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[8]。當(dāng)前研究[9-10]表明,沙庫巴曲纈沙坦通過降低TGF-β表達(dá)和通過影響心房肌的鈣離子通道抑制心房纖維化的進(jìn)展。最新研究[11]發(fā)現(xiàn)乳脂球-EGF因子8通過負(fù)向調(diào)控TGF-β/Smad2/3抑制心房纖維化,但具體作用機(jī)制尚不明確。臨床上,AF患者亟需改善心肌重構(gòu)治療新途徑[12],但對于心房纖維化尚無明確的治療策略,AF患者心房纖維化的機(jī)制需要更多的探索與研究。本研究顯示AF大鼠心房增大,心房發(fā)生纖維化,同時(shí)ET-1/SOCC/TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)上調(diào),抑制SOCC的同時(shí)抑制了HL-1細(xì)胞中的TGF-β蛋白的表達(dá),初步表明了ET-1/SOCC/TGF-β信號(hào)通路對心房纖維化的促進(jìn)作用,拮抗其中相關(guān)分子可能能夠有效干預(yù)AF和心房纖維化進(jìn)展。

ET-1是人類重要的內(nèi)皮素亞型之一,主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌,可以作為細(xì)胞因子或與其受體結(jié)合在組織纖維化中發(fā)揮重要作用,心臟中存在ETA和ETB受體,其中內(nèi)皮素受體拮抗劑波生坦已被證明可以減少高血壓和修復(fù)性心肌纖維化動(dòng)物模型中纖維化心肌的重構(gòu)[13]。最近研究[2]表明,AF患者血清ET-1水平顯著升高,與AF持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān),且在射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的AF患者中ET-1水平較高,表明ET-1在AF發(fā)生和維持過程中發(fā)揮重要作用。AF患者心耳ET-1和COL-Ⅰ表達(dá)及膠原纖維沉積增多,且COL-Ⅰ表達(dá)水平與ET-1表達(dá)水平呈正相關(guān),提示ET-1可能通過促進(jìn)心房纖維化而參與AF的發(fā)生[3],但具體機(jī)制尚不明確。本研究顯示AF大鼠心房組織中ET-1表達(dá)增加,HL-1細(xì)胞培養(yǎng)后ET-1誘導(dǎo)TGF-β合成增加,提示ET-1/TGF-β可能參與AF和心房纖維化的過程。

SOCC與心肌纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。Orai1和STIM1作為SOCC兩個(gè)重要分子基礎(chǔ),在心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。藥理研究[14]表明,SOCC和非選擇性陽離子通道是ET-1誘導(dǎo)平滑肌收縮、絲裂原活化蛋白激酶磷酸化和花生四烯酸釋放的重要鈣內(nèi)流途徑。但ET-1誘導(dǎo)的心肌纖維化過程中,SOCC是否參與其中尚不明確。最近研究[15]表明,Orai1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流的上調(diào),增強(qiáng)人心房成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力。本研究顯示HL-1細(xì)胞中Orai1表達(dá)降低后ET-1的誘導(dǎo)不再使TGF-β蛋白表達(dá)水平升高,表明Orai1參與ET-1誘導(dǎo)心房纖維化的過程。

綜上所述,本研究探索了通過ET-1/SOCC/TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)AF大鼠發(fā)生心房纖維化,拮抗該信號(hào)通路中相關(guān)分子如Orai1可能會(huì)有效干預(yù)心房纖維化在AF發(fā)生中的進(jìn)展。此結(jié)果為改善AF患者心房纖維化提供了新的治療方向與藥物靶點(diǎn)。然而ET-1是作為細(xì)胞因子或是與其受體結(jié)合調(diào)控SOCC/TGF-β尚未得到具體研究,因此也將成為下一步實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。