去泛素化酶OTUB2通過(guò)誘導(dǎo)DDX54活性增加中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的形成以及促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力和侵襲能力

蔣良君,李 衛(wèi)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)又稱大腸癌,是一種起源于大腸上皮組織的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年上升,明確結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于該疾病的診斷和治療具有重要意義[1]。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)是一種由脫聚染色質(zhì)和顆粒蛋白組成的細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),由活化的中性粒細(xì)胞在特定的刺激下產(chǎn)生并釋放,NETs在先天性免疫和癌癥轉(zhuǎn)移中起著重要作用[2]。含OTU結(jié)構(gòu)域的泛素醛結(jié)合蛋白2 (OTU deubiquitinase,ubiquitin aldehyde binding 2,OTUB2)是一種去泛素化酶,也被證明是一種致癌因子,研究[3]顯示OTUB2在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),過(guò)表達(dá)OTUB2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。OTUB2可通過(guò)抑制丙酮酸激酶M2型同工酶的泛素化誘導(dǎo)癌細(xì)胞糖酵解進(jìn)而促進(jìn)CRC進(jìn)展[4]。此外,研究[5]表明RNA解螺旋酶54(DEAD-box helicase 54,DDX54)在CRC組織中高表達(dá),與腫瘤的生長(zhǎng)和不良預(yù)后有關(guān)。然而關(guān)于OTUB2調(diào)控DDX54在CRC中的作用和相關(guān)的分子機(jī)制仍不明確。該研究旨在探討去泛素化酶OTUB2調(diào)控DDX54 對(duì)NETs的形成和CRC細(xì)胞活力、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器人CRC細(xì)胞系(HCT116、SW480、DLD-1)和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)(武漢尚恩生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):SNL-077、SNL-074、SNL-076、SNL-519);OTUB2野生型SW480細(xì)胞(OTUB2-WT)以及OTUB2敲除SW480細(xì)胞(OTUB2-KO)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司,貨號(hào):12634010);佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(美國(guó)MedChem Express公司,貨號(hào):HY-18739);脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase,GST)抗體和組氨酸(histidine,His)抗體(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):D21962、G6511、GT359);vector、OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、si-OTUB2、si-DDX45及相應(yīng)的陰性對(duì)照(廣州銳博生物科技有限公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):D8372);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、Lipofectamine 3000試劑、TRIzol試劑、蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖珠(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào):A5669701、L3000075、15596018、78609);人外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):P9040);ELISA試劑盒:白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)(貨號(hào):ab214030)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)(貨號(hào):ab181421)、一抗:MPO(貨號(hào):ab208670)、Cit-H3(貨號(hào):ab219407)、OTUB2(貨號(hào):ab74371)、抗泛素抗體(ab7780)、DDX54(貨號(hào):ab76947),二抗:HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(貨號(hào):ab6721)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)-DNA復(fù)合物ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司,貨號(hào):RJ23716);瓜氨酸組蛋白H3(citrullinated histone H3,Cit-H3)ELISA試劑盒(武漢紐萊生物科技有限公司,貨號(hào):NLH7890);Transwell小室(美國(guó)康寧公司,貨號(hào):3412);MTT溶液、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C0009S、C0121、P0013B、P0009);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司,貨號(hào):HVLP02500);ECL試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司,貨號(hào):1705061);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix、SYBR Green qPCR Master試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號(hào):R232-01、Q111-02); 大腸埃希菌BL21(上海澤葉生物科技有限公司,貨號(hào):ZY-12-174Y);HisTrap HP層析柱(上海桂寧實(shí)驗(yàn)器材有限公司,貨號(hào):17-5247-01)、谷胱甘肽-瓊脂糖4B層析柱(上海信裕生物科技有限公司,貨號(hào):XY90421);Illumina測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司,型號(hào):MiSeq);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號(hào):LightCycler 96);酶標(biāo)儀(德國(guó)BioTek公司,型號(hào):Cytation 5);熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司,型號(hào):Axio Imager 2);紅外成像系統(tǒng) (美國(guó)LI-COR公司,型號(hào):Odyssey);紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):Nanodrop 2000)。

1.2 方法

1.2.1臨床樣本收集 收集2021年4月—2022年1月期間在南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC患者的癌組織與癌旁組織(距離癌組織3 cm),共61例。納入標(biāo)準(zhǔn)如下:① 病理活檢診斷為CRC的患者;② 初次被診斷為CRC且之前未患過(guò)其他癌癥;③ 術(shù)前未接受過(guò)手術(shù)切除、放化療等任何形式的治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并有肝、腎、心臟等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者;② 臨床資料不完整的患者。所有患者均簽署書面知情同意書且本研究經(jīng)過(guò)南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案(批號(hào):NHYY2021a025)。標(biāo)本放置在-80 ℃條件下保存。

1.2.2中性粒細(xì)胞分離和NETs誘導(dǎo) 收集CRC患者的外周血樣本,使用外周血中性粒細(xì)胞提取試劑盒分離外周血中性粒細(xì)胞,分離的原代中性粒細(xì)胞在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將中性粒細(xì)胞分為對(duì)照組(中性粒細(xì)胞不做任何處理)、PMA組(中性粒細(xì)胞加入10 mmol/L NETs釋放激活劑PMA)、PMA+DNase Ⅰ組(中性粒細(xì)胞被PMA處理后加入100 U/ml NETs抑制劑)。首先將外周血中分離的中性粒細(xì)胞(密度1×106)接種于24孔板中黏附1 h。PMA組加入100 nmol/L的PMA刺激4 h,PMA+DNase Ⅰ組在加入PMA的同時(shí)加入100 U/ml的DNase Ⅰ。各組細(xì)胞上清液用于ELISA檢測(cè)。收集PMA組中含有NETs的上清液,在4 ℃下以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,再以40 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min以得到純化的NETs,儲(chǔ)存在-80 ℃下以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CRC細(xì)胞培養(yǎng) 人CRC細(xì)胞系(HCT116、SW480、DLD-1)和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)在DMEM培養(yǎng)基(添加有10%FBS和1%青-鏈霉素)中培養(yǎng),并置于37 ℃、5%CO2加濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將SW480細(xì)胞接種于24孔板中,在37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。使用Lipofectamine 3000試劑將OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對(duì)照vector和siRNA(si-OTUB2、si-DDX54)及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照(si-NC)轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,使用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并用于后續(xù)研究。使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)將中性粒細(xì)胞和CRC細(xì)胞共培養(yǎng),中性粒細(xì)胞接種于Transwell下腔,SW480細(xì)胞接種于Transwell上腔,具體細(xì)胞分組如下:對(duì)照組、NETs組、vector組、OTUB2組、OTUB2+DNase Ⅰ組、si-OTUB2組、NETs+si-OTUB2組、OTUB2+si-NC組和OTUB2+si-DDX54組。對(duì)照組SW480細(xì)胞不做任何處理,NETs組、NETs+si-OTUB2組(分別使用SW480細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了si-OTUB2的SW480細(xì)胞與PMA處理的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)),vector組、OTUB2組、si-OTUB2組、OTUB2+si-NC組、OTUB2+si-DDX54組(分別與轉(zhuǎn)染了vector、OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、si-OTUB2、OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和si-NC、OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和si-DDX54的SW480細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)),OTUB2+DNase Ⅰ組(轉(zhuǎn)染了OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SW480細(xì)胞與DNase Ⅰ處理的中性粒細(xì)胞共培養(yǎng))。

1.2.5ELISA檢測(cè)IL-8、TNF-α、MPO-DNA復(fù)合物水平和Cit-H3濃度 收集健康對(duì)照組和CRC患者血清樣本,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明中的要求檢測(cè)IL-8和TNF-α的濃度;收集與NETs共培養(yǎng)后的SW480細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min后取上清液。使用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中MPO-DNA復(fù)合物相對(duì)表達(dá)量和Cit-H3濃度。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取各組SW480細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后,使用5% BSA將轉(zhuǎn)移后的膜封閉2 h,并與一抗:抗MPO(1∶1 000)、抗Cit-H3(1∶1 000)、抗OTUB2(1∶1 000)和抗DDX54(1∶2 000)在 4 ℃ 下孵育過(guò)夜,然后與HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。TBST 溶液洗膜 3次,ECL顯色,ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量。

1.2.7MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞接種于96孔板(2×103)中孵育過(guò)夜,之后按照MTT試劑盒說(shuō)明書要求對(duì)各組細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞活力(%)=(待測(cè)樣品吸光度值﹣背景吸光度值)/(對(duì)照樣品吸光度值﹣背景吸光度值)×100%。

1.2.8Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 已轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞胰酶消化后,重懸于無(wú)血清的培養(yǎng)基中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。Transwell小室(孔徑8 μm)的上室預(yù)包埋有基質(zhì)膠,然后向上室中加入各組細(xì)胞,下室中加入600 μl含10%FBS的培養(yǎng)基。孵育24 h后,取出Transwell膜,用棉簽擦去未侵入的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.9qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 使用TRIzol試劑分別提取各組SW480細(xì)胞和CRC患者癌組織和癌旁組織中的RNA,Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度和純度。跟據(jù)HiScript Ⅱ Q RT Super Mix的說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后通過(guò)SYBR Green qPCR Master試劑盒在Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參,具體引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.10生物信息學(xué)分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu)用于分析OTUB2和DDX54在CRC中的表達(dá)。StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)(https://starbase.sysu.edu.cn)用于預(yù)測(cè)OTUB2的結(jié)合蛋白。采用韋恩圖在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取RNA測(cè)序得到的敲減OTUB2后SW480細(xì)胞中的差異表達(dá)基因以及OTUB2的結(jié)合蛋白的交集。Timer數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)預(yù)測(cè)OTUB2表達(dá)和中性粒細(xì)胞的相關(guān)性。

1.2.11RNA測(cè)序 在人CRC細(xì)胞SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-OTUB2,從細(xì)胞中分離RNA,DNase Ⅰ處理總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量;將純化后的RNA進(jìn)行rRNA去除、片段化并且合成cDNA、修復(fù)cDNA末端、連接接頭后構(gòu)建測(cè)序樣本文庫(kù);通過(guò)RNA測(cè)序測(cè)定敲減OTUB2后SW480細(xì)胞中的所有差異表達(dá)基因。依據(jù)cBot用戶指南指示的流程,在Illumina測(cè)序儀的cBot上生成Cluster和測(cè)序引物雜交,準(zhǔn)備測(cè)序試劑并將含cluster的flow cell上機(jī)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。差異因子篩選條件為P<0.05且差異倍數(shù)≥1。

1.2.12免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)反應(yīng)和Western blot實(shí)驗(yàn) Co-IP實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證OTUB2和DDX54的相互作用。收集SW480細(xì)胞,將細(xì)胞使用裂解緩沖液裂解、胰蛋白酶消化后加入OTUB2(1∶1 000)、DDX54抗體(1∶2 000)和山羊抗兔IgG(1∶2 000)抗體在4 ℃下孵育4 h,之后加入蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖珠捕捉抗原抗體復(fù)合物,收集沉淀后的蛋白行Western blot檢測(cè)。Co-IP檢測(cè)OTUB2對(duì)DDX54的泛素化修飾時(shí),首先對(duì)OTUB2-WT和OTUB2-KO細(xì)胞進(jìn)行裂解,之后向上清中加入抗泛素抗體(HA-Ubi)(1∶1 000)、HA-Ub-DDX54,將抗體與蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖珠結(jié)合,使用緩沖液洗滌后行Western blot檢測(cè)。

1.2.13蛋白質(zhì)純化與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶親和純化(glutathione s-transferase pull down,GST pull down) 采用GST pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OTUB2和DDX54的互作用。重組 His 標(biāo)記的 OTUB2和DDX54在大腸埃希菌BL21中表達(dá),并使用HisTrap HP層析柱進(jìn)行純化。GST標(biāo)記的OTUB2和DDX54也在大腸埃希菌BL21中表達(dá),并使用谷胱甘肽-瓊脂糖4B層析柱進(jìn)行純化。對(duì)于體外GST pull-down測(cè)定,GST標(biāo)記蛋白與帶有His標(biāo)簽的蛋白在PBS中4 ℃下孵育2 h。接下來(lái),將谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂添加到緩沖液中,并將混合物在4 ℃下孵育3 h。將珠子用PBS緩沖液洗滌3次,并用30 μl 2×SDS上樣緩沖液煮沸,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.14His-tag pull-down His-tag pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證OTUB2對(duì)DDX54的泛素化修飾情況。轉(zhuǎn)染OTUB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的SW480細(xì)胞室溫下在8 ml His-tag pull down裂解緩沖液中裂解2 h。將細(xì)胞裂解物與50 μl Ni NTA珠在室溫下孵育6 h。用 His-tag pull-down 洗滌緩沖液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ依次洗滌珠子。珠子在30 μl His-tag pull-down 洗脫緩沖液中洗脫,并用 30 μl 2×SDS上樣緩沖液煮沸。對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析,多組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者外周血中NETs的形成增加并促進(jìn)CRC細(xì)胞活力和侵襲當(dāng)中性粒細(xì)胞釋放NETs時(shí),它們會(huì)釋放一系列的細(xì)胞因子,包括TNF-α和IL-8。與健康對(duì)照組相比,CRC組患者外周血中NETs相關(guān)因子TNF-α和IL-8的水平上調(diào)(t=9.79、10.15,均P<0.001)(圖1A)。與對(duì)照組相比,PMA組中性粒細(xì)胞MPO和Cit-H3蛋白表達(dá)上調(diào)(q=19.09、22.49,均P<0.001);與PMA組相比,使用PMA+DNase Ⅰ處理后,MPO和Cit-H3蛋白表達(dá)降低(q=11.34、16.25,均P<0.001),表明PMA成功誘導(dǎo)NETs形成,而DNase Ⅰ抑制了NETs水平(圖3B)。將分離的NETs用于處理SW480細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞活力與侵襲,與對(duì)照組相比,NETs處理組細(xì)胞活力和侵襲增加(t=7.69、6.72,均P<0.01)(圖3C、D)。

圖1 NETs分離及其對(duì)CRC細(xì)胞活力和侵襲的影響

2.2 OTUB2在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá)并與中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示OTUB2在CRC組織中的表達(dá)高于癌旁組織(圖2A);與癌旁組織相比,CRC患者癌組織中OTUB2的mRNA表達(dá)上調(diào)(t=8.51,P=0.001)(圖2B),并且OTUB2 mRNA和蛋白在CRC細(xì)胞中的表達(dá)均高于NCM460細(xì)胞(q=8.11、12.89、10.70、7.59、16.48、9.99,均P<0.01)(圖2C、D)。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,在CRC中OTUB2的表達(dá)與中性粒細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)(r=0.16,P=0.001)(圖2E)。

圖2 OTUB2在CRC組織和細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)以及OTUB2與中性粒細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.3 過(guò)表達(dá)OTUB2增加NETs的形成并促進(jìn)CRC細(xì)胞活力和侵襲qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)OTUB2后OTUB2的mRNA水平高于vector組(t=9.47,P<0.001)(圖3A)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與vector組相比,OTUB2組MPO-DNA復(fù)合物相對(duì)表達(dá)量和Cit-H3的濃度上調(diào)(q=19.29、12.92,均P<0.001)、細(xì)胞活力和侵襲能力提高(q=11.11、18.32,均P<0.001);與OTUB2組相比,OTUB2+DNase Ⅰ組MPO-DNA復(fù)合物相對(duì)表達(dá)量和Cit-H3的濃度降低(q=13.33、8.88,均P<0.001)、細(xì)胞活力和侵襲能力被抑制(q=7.90、11.20,均P<0.01)(圖3B-D)。提示過(guò)表達(dá)OTUB2能夠促進(jìn)NETs的形成并促進(jìn)CRC細(xì)胞的活力和侵襲。

圖3 共培養(yǎng)系統(tǒng)中NETs形成以及各組CRC細(xì)胞活力和侵襲的檢測(cè)結(jié)果

2.4 敲低OTUB2逆轉(zhuǎn)NETs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞活力和侵襲qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組,si-OTUB2組細(xì)胞的OTUB2 mRNA表達(dá)降低、細(xì)胞活力和侵襲能力也降低(t=4.04,q=7.28、8.56,均P<0.01)(圖4A),NETs組細(xì)胞活力和侵襲增加(q=14.51、11.61,均P<0.001)。而與NETs組相比,敲低OTUB2后NETs+si-OTUB2組細(xì)胞活力和侵襲被抑制(q=11.25、12.38,均P<0.01)(圖4B、C)。提示敲減OTUB2能夠抑制NETs誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞的活力和侵襲能力。

圖4 各組細(xì)胞活力和侵襲檢測(cè)結(jié)果

2.5 OTUB2直接調(diào)控DDX54的表達(dá)為了研究OTUB2在CRC中作用的機(jī)制,本研究在CRC細(xì)胞中敲低OTUB2并做RNA測(cè)序(圖5A)。將測(cè)序差異顯著的前100個(gè)基因和StarBase中預(yù)測(cè)的OTUB2的結(jié)合蛋白取交集,發(fā)現(xiàn)共3個(gè)交集分子:DDX54(差異倍數(shù)=-1.37013298)、IGF2BP1(差異倍數(shù)=1.7614246)、ABHD2(差異倍數(shù)=0.9325771)(圖5B)。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示DDX54在CRC癌組織中高表達(dá)(P=1.624-12)(圖5C),qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示DDX54在本研究納入的CRC患者癌組

圖5 OTUB2和DDX54的結(jié)合驗(yàn)證

織中表達(dá)上調(diào)(t=7.72,P<0.001)(圖5D)。與NCM460細(xì)胞相比,DDX54 mRNA和蛋白在CRC細(xì)胞系中均高表達(dá)(q=7.13、13.27、10.70、7.48、16.79、13.59,均P<0.01)(圖5E、F)。co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在DDX54抗體免疫沉淀的蛋白質(zhì)中可檢測(cè)到OTUB2蛋白,在OTUB2抗體免疫沉淀的蛋白質(zhì)中可檢測(cè)到DDX54蛋白,表明二者發(fā)生了共沉淀(圖5G)。GST-pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,在GST-DDX54融合蛋白中可檢測(cè)到OTUB2蛋白,在GST-OTUB2融合蛋白中可檢測(cè)到DDX54蛋白。(圖5H)。提示 OTUB2能夠與DDX54結(jié)合,OTUB2可能是DDX54的去泛素化酶。

2.6 OTUB2抑制DDX54的泛素化對(duì)OTUB2和DDX54的泛素化修飾情況進(jìn)行His pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果顯示,相對(duì)于加入了DDX54和His-Ubi抗體的SW480細(xì)胞,加入了DDX54、His-Ubi以及OTUB2抗體后SW480細(xì)胞中DDX54的泛素化水平被抑制(圖6A)。Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,在SW480細(xì)胞中敲除OTUB2后,DDX54的泛素化增加,而進(jìn)一步加入OTUB2抗體后,DDX54的泛素化被抑制(圖6B)。這些結(jié)果表明OTUB2抑制DDX54的泛素化。

圖6 OTUB2影響DDX54的泛素化的檢測(cè)結(jié)果

2.7 敲低DDX54減弱過(guò)表達(dá)OTUB2誘導(dǎo)的NETs的形成、CRC細(xì)胞活力和侵襲圖7A檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于vector組,OTUB2組的OTUB2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)(t=10.46,P<0.001)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與OTUB2+si-NC組相比,敲低DDX54后共培養(yǎng)系統(tǒng)中MPO-DNA復(fù)合物相對(duì)表達(dá)量和Cit-H3的濃度降低(q=12.23、8.00,均P<0.001)(圖7B),細(xì)胞活力和侵襲被抑制(q=7.22、10.29,均P=<0.01)(圖7C、D)。提示敲低DDX54能夠抑制OTUB2誘導(dǎo)的NETs形成和降低CRC細(xì)胞的活力和侵襲能力。

圖7 敲低DDX54減弱過(guò)表達(dá)OTUB2誘導(dǎo)的NETs的形成和CRC細(xì)胞增殖和侵襲

3 討論

本研究結(jié)果顯示,去泛素化酶OTUB2在CRC中表達(dá)增強(qiáng),OTUB2能夠增加NETs的形成并促進(jìn)CRC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,該作用的實(shí)現(xiàn)可能與增強(qiáng)DDX54的活性有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究OTUB2和DDX54之間的相互作用以及它們?cè)贑RC治療中的潛在價(jià)值提供了重要依據(jù)。

中性粒細(xì)胞是數(shù)量最多的免疫細(xì)胞,與腫瘤細(xì)胞協(xié)同促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[6]。研究[7]表明,高水平的腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞與CRC的較差預(yù)后有關(guān)。NETs是中性粒細(xì)胞獨(dú)特的產(chǎn)物,可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。此外,還有研究[9]表明靶向抑制腫瘤中NETs的形成或活性是癌癥治療的潛力策略。本研究通過(guò)生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站顯示,OTUB2在CRC中與中性粒細(xì)胞呈正相關(guān),體外實(shí)驗(yàn)顯示,過(guò)表達(dá)OTUB2促進(jìn)NETs的形成以及CRC細(xì)胞的增殖和侵襲,而敲低OTUB2減弱NETs介導(dǎo)的CRC細(xì)胞增殖和侵襲。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要機(jī)制,泛素酶E1、E2、E3通過(guò)催化靶蛋白的的泛素化使其降解,而泛素特異性蛋白酶(deubiquitinating enzyme,DUB)通過(guò)去除靶蛋白中的泛素鏈抑制其泛素化從而增強(qiáng)靶基因的穩(wěn)定性[10]。OTUB2是卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域(ovarian tumor domain,OTU)家族成員之一。研究[11]表明,OTUB2一方面通過(guò)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸促進(jìn)腫瘤進(jìn)展;另一方面通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,如OTUB2可以介導(dǎo)Hippo通路的下游分子YAP/TAZ去泛素化。OTUB2去泛素化酶活性在腫瘤中的致癌作用已被廣泛報(bào)道,且研究[4]顯示,敲低OTUB2可以抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)DDX54是OTUB2的潛在靶點(diǎn),qRT-PCR結(jié)果表明DDX54在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá),co-IP和GST-pull-down實(shí)驗(yàn)顯示OTUB2可以直接與DDX54結(jié)合,His-tag pull down和免疫沉淀分析表明OTUB2通過(guò)去泛素化增強(qiáng)DDX54的活性。據(jù)報(bào)道[12],無(wú)論DNA是否存在損傷DDX54均可促進(jìn)細(xì)胞存活,且DDX54 在9種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào),可以作為一種新的腫瘤標(biāo)記物。此外,研究[5,13]表明DDX54在包括CRC在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)上調(diào),促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲。在本研究中,敲低DDX54能夠抑制過(guò)表達(dá)OTUB2介導(dǎo)的促癌作用。

綜上所述,本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明NETs在CRC患者中高表達(dá),并促進(jìn)促進(jìn)CRC細(xì)胞活力和侵襲;OTUB2通過(guò)抑制DDX54的泛素化從而調(diào)節(jié)NETs的生成和CRC細(xì)胞的活力和侵襲。上述研究結(jié)果揭示了OTUB2在CRC發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵作用,使其成為CRC的潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。