膿毒癥相關(guān)肺損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的鐵死亡機(jī)制研究

金子琦,唐 波,吳章宏,肖 寶,劉 斌,鐘 揚(yáng),胡 霞

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種復(fù)雜的病理生理綜合征,發(fā)病率高,但其發(fā)病機(jī)制仍有待探討[1]。鐵死亡是一種獨(dú)特的鐵依賴形式的程序性細(xì)胞死亡,其生化特征主要包括細(xì)胞內(nèi)鐵的積聚和大量脂質(zhì)過氧化[2]。目前,鐵死亡被認(rèn)為是參與脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的重要因素,用鐵抑制素-1(ferrostatin-1,Fer-1)抑制鐵死亡可顯著緩解ALI[3]。因此,阻斷鐵死亡可能作為ARDS的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。研究[4]表明,鐵死亡受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERs)的調(diào)節(jié),如蛋白激酶RNA樣ER激酶(protein kinase RNA-like-ER kinase,PERK)-激活轉(zhuǎn)錄因子 4(activating transcription factor 4,ATF4)途徑參與介導(dǎo)鐵死亡。在ERs情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形狀和功能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分的選擇性自噬得到良好維持[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬由各種受體介導(dǎo);其中,序列相似性家族134成員B(family with sequence similarity 134 member B,FAM134B)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)自噬體受體,其能靶向自噬體中的片段化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,用于溶酶體降解[6]。最近研究[7]顯示FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬保護(hù)膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷。此外,FAM134B介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬參與激活肝細(xì)胞癌鐵死亡[8]。該研究通過探討FAM134B介導(dǎo)的ER自噬和鐵死亡之間的相互作用,旨在揭示ERs相關(guān)鐵死亡在ARDS肺損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 小鼠肺泡上皮細(xì)胞(alveol epithelial cells,AECs)系MLE12細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)成年雄性C57BL/6J小鼠(6周齡,22～24 g)購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)在濕度為50%～60%、溫度為24～26 ℃且光照/黑暗周期為12 h的受控環(huán)境中。

1.1.3主要材料 CCK-8試劑盒(貨號(hào):CA1215-100T)、二甲苯(貨號(hào):DM0105)、蘇木精和曙紅(貨號(hào):G1120)、Triton X-100(貨號(hào):P1080)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(貨號(hào):D8370)購自北京Solarbio公司,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(貨號(hào):L-2880)、脂質(zhì)過氧化丙二醛(malondialdehyde,MDA)分析試劑盒(貨號(hào):MAK085)購自美國Sigma公司,鐵分析試劑盒(貨號(hào):D153-6)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒(貨號(hào):A006-2)購自南京建成生物工程研究所,抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)(貨號(hào):CL594-67763)、β-肌動(dòng)蛋白(貨號(hào):bsm-33036M)、環(huán)加氧酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)(貨號(hào):66351-1-Ig)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)(貨號(hào):66574-1-Ig)、ATF4(貨號(hào):60035-1-Ig)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)(貨號(hào):66741-1-Ig)、FAM134B(貨號(hào):21537-1-AP)、Alexa Fluor 568偶聯(lián)的次級(jí)抗體(貨號(hào):A20185)購自美國Proteintech公司,DAPI(貨號(hào):H-1200)購自美國Vector Laboratory公司,組織蛋白提取物緩沖液(貨號(hào):89900)、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(貨號(hào):23227)購自美國Thermo Fisher公司,4-羥基壬烯醛(4-HNE)(貨號(hào):GP2035)、山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):GB25303)、兔抗小鼠IgG二抗(貨號(hào):GB23303)購自武漢Servicebio公司。Vector、FAM134B過表達(dá)質(zhì)粒(貨號(hào):D02008、M-21542)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.1.4主要儀器 DM2000熒光顯微鏡購自德國Leica公司,Tanon V8快速蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)購自上海Tanon公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組與處理 MLE12細(xì)胞在37 ℃下在含有2%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶體積的80%～90%時(shí),在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞。用LPS(0、1、2、5 μg/ml)處理細(xì)胞24 h以確定LPS對(duì)MLE12氧化應(yīng)激和Fe2+水平的影響。為了驗(yàn)證鐵死亡在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用,將細(xì)胞分為對(duì)照(Con)組、鐵死亡特異性抑制劑(Fer-1)組、LPS組和LPS+Fer-1組;LPS+Fer-1組在LPS處理前6 h,用10 μmol/L Fer-1預(yù)處理,隨后將細(xì)胞暴露于5 μg/ml LPS (預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的在24 h誘導(dǎo)幾乎一半的MLE12細(xì)胞活力降低的濃度)24 h,Con組用融媒DMSO處理24 h,Fer-1組用10 μmol/L Fer-1預(yù)處理6 h,隨后用DMSO處理24 h,LPS組將細(xì)胞暴露于5 μg/ml LPS 24 h;為了研究ER自噬在LPS引起的細(xì)胞鐵死亡中的作用,將細(xì)胞分為Con+載體(Vector)組、Con+FAM134B組、LPS+Vector組、LPS+FAM134B組,細(xì)胞用Vector或FAM134B過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后,暴露或不暴露于5 μg/ml LPS 24 h。

1.2.2CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 采用CCK-8試劑盒說明書檢測(cè)所有組MLE12細(xì)胞活力。

1.2.3鐵含量測(cè)定 使用按照鐵分析試劑盒說明書測(cè)量不同濃度(0、1、2、5 μg/ml)LPS處理組和Con組、Fer-1組、LPS組和LPS+Fer-1組細(xì)胞的鐵濃度。將MLE12細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞)在6倍體積鐵分析緩沖液中快速勻漿,加入相關(guān)試劑。最后,在593 nm處測(cè)量吸光度,并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵濃度。

1.2.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 將40只小鼠隨機(jī)分成Con+Vector組、Con+FAM134B組、LPS+Vector組、LPS+FAM134B組,每組10只;LPS+Vector組、LPS+FAM134B組小鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉,腹腔注射30 mg/kg LPS誘導(dǎo)膿毒癥[9]。Con+Vector組、Con+FAM134B組小鼠腹腔注射相同劑量的PBS,Con+FAM134B組和LPS+FAM134B組小鼠在腹腔注射LPS前3天,用經(jīng)鼻滴注的方法將基于腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)的FAM134B過表達(dá)質(zhì)粒(1×1012vg/ml,60 μl)對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù),用于特異性表達(dá)FAM134B,腹腔注射LPS 12 h后處死小鼠。

1.2.5HE染色和免疫組化染色 將小鼠的整個(gè)左肺固定在4%多聚甲醛中,石蠟包埋,并切成4 μm的切片。然后將切片進(jìn)行HE染色、4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)免疫組化染色和GPX4免疫熒光分析。對(duì)于HE染色,將切片用蘇木精和曙紅染色,并固定在載玻片上,通過顯微鏡觀察。對(duì)于免疫組化染色,組織切片首先在60 ℃下烘烤2 h,然后用二甲苯脫蠟,并通過乙醇梯度再水合。然后在枸櫞酸鹽緩沖液中于95 ℃加熱30 min并冷卻至室溫,對(duì)載玻片進(jìn)行抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性和血清封閉后,將切片與抗4-HNE單克隆抗體(1∶50)4 ℃孵育過夜,隨后,將切片與生物素化連接的第二抗體在37 ℃孵育1 h,然后用DAB顯色溶液進(jìn)行DAB顯色反應(yīng),細(xì)胞核復(fù)染和脫水后,用倒置顯微鏡拍攝組織切片圖像。

1.2.6免疫熒光染色 切片用10%山羊血清和0.1% Triton X-100 37 ℃封閉1 h,然后加入抗GPX4(1∶100)初級(jí)抗體,4 ℃孵育過夜,然后將切片與Alexa Fluor 568偶聯(lián)的次級(jí)抗體在37 ℃孵育1 h,用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.7Fe2+水平、MDA和GSH測(cè)定 收集肺組織(10 mg)或MLE12細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞),并使用Fe2+、脂質(zhì)過氧化MDA分析試劑盒和GSH試劑盒測(cè)量MDA、GSH含量。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法 采用組織蛋白提取物緩沖液制備小鼠肺組織及所有組的細(xì)胞的總蛋白,并使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小使用10%或15% SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白質(zhì),然后將蛋白質(zhì)結(jié)合到PVDF膜上,隨后用5%脫脂乳封閉3 h。此外,根據(jù)制造商提供的參考濃度,將PVDF膜與特異性一抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶2 000)、PTGS2(1∶800)、GPX4(1∶1 000)、GRP78(1∶1 200)、ATF4(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)和FAM134B(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后,PVDF膜與山羊抗兔或兔抗小鼠IgG二抗(1∶20 000)在室溫下孵育2 h。最后,使用ECL蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定鐵死亡標(biāo)記物PTGS2和GPX4、ERs標(biāo)志物GRP78、ATF4和CHOP以及介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的主要受體之一的FAM134B的蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì) MLE12細(xì)胞活力、鐵死亡、氧化應(yīng)激和Fe2+水平的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,LPS處理以劑量依賴性降低MLE12細(xì)胞活力(F=23.54,P<0.001),并且當(dāng)LPS的濃度為5 μg/ml時(shí),MLE12細(xì)胞活力下降至52%(圖1)。LPS處理以劑量依賴性增加PTGS2和降低GPX4水平(F=21.77、28.72,均P<0.001)(圖2),表明LPS暴露導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。此外,LPS處理還導(dǎo)致MLE12細(xì)胞中MDA、Fe2+的劑量依賴性增加(F=12.19、10.96,均P<0.001)(圖3A、B),表明LPS暴露導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)過氧化和鐵的積聚。此外,LPS處理以劑量依賴的方式降低了MLE12細(xì)胞中的GSH水平(F=18.64,P<0.001)(圖3C),表明LPS處理使MLE12細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)受損。

圖1 不同濃度LPS對(duì)MLE12細(xì)胞活力的影響

圖2 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)MLE12細(xì)胞鐵死亡的影響

圖3 不同濃度LPS處理MLE12細(xì)胞中丙二醛、Fe2+含量和相對(duì)谷胱甘肽的比較

2.2 Fer-1減輕LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞活力降低、鐵死亡、氧化應(yīng)激和Fe2+水平的增加如圖4-6所示,與Con組相比,LPS組活力降低降低(t=4.28,P<0.001),PTGS2蛋白水平、MDA和Fe2+水平增加(t=12.03、5.52、8.17,均P<0.001),GPX4蛋白和GSH水平降低(t=4.60、4.98,P<0.001);與LPS組相比,LPS+Fer-1組細(xì)胞活力增加(t=3.51,P=0.005),PTGS2蛋白水平、MDA和Fe2+水平降低(t=6.90、3.07、3.50,均P<0.05),GPX4蛋白和GSH水平增加(t=3.39、3.45,P=0.008、0.006)。提示Fer-1能夠減輕LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞活力降低、鐵死亡、氧化應(yīng)激和Fe2+水平的增加。

圖4 Fer-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞活力降低的影響

圖5 Fer-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞鐵死亡的影響

圖6 Fer-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞氧化應(yīng)激和Fe2+水平增加的影響

2.3 FAM134B通過抑制ERs改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、鐵死亡和氧化應(yīng)激增加LPS處理以劑量依賴性增加MLE12細(xì)胞中GRP78、ATF4和CHOP水平(F=11.63、24.92、10.10,均P<0.001),降低FAM134B水平(F=19.72,P<0.001)(圖7)。表明LPS誘導(dǎo)MLE12細(xì)胞ERs并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。與LPS+Vector組相比,LPS+FAM134B組細(xì)胞中ATF4、CHOP和PTGS2蛋白水平降低(t=6.50、5.83、5.38,P<0.001),GPX4和FAM134B蛋白水平增加(t=6.22、6.65,P<0.001),細(xì)胞活力增加(t=3.526,P=0.004)(圖8-10)。同時(shí),LPS+FAM134B組細(xì)胞的MDA水平低于LPS+Vector組(t=3.11,P=0.021),和GSH水平高于LPS+Vector組(t=3.41,P=0.006)(圖11)。提示FAM134B通過抑制ERs改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低、鐵死亡和氧化應(yīng)激增加。

圖7 不同濃度LPS對(duì)MLE12細(xì)胞ERs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的影響

圖8 FAM134B對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞ERs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬抑制的影響

圖9 FAM134B對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞活力降低的影響

圖10 FAM134B對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞鐵死亡的影響

圖11 FAM134B對(duì)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.4 FAM134B過度表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥損傷HE染色分析結(jié)果顯示,與Con+Vector組小鼠相比,LPS+Vector組小鼠肺組織中出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡隔膜增厚、肺泡水腫。FAM134B+LPS組小鼠肺組織中中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡隔膜增厚以及肺泡水腫較LPS+Vector組減輕(圖12A);與Con+Vector組小鼠相比,LPS+Vector組小鼠肺組織中4-HNE、ATF4和CHOP表達(dá)水平增加(t=5.36、3.87、4.35,均P<0.01),GPX4、FAM134B表達(dá)水平降低(t=5.07、5.64,均P<0.001)。說明LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織ERs并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。與LPS+Vector組相比,LPS+FAM134B組小鼠肺組織中4-HNE、ATF4、CHOP表達(dá)水平降低(t=3.88、3.55、5.61,均P<0.01),GPX4、FAM134B表達(dá)水平增加(t=2.87、5.07,均P<0.05)(圖12B-G)。說明FAM134B過度表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥損傷。

圖12 FAM134B過度表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部損傷的影響(n=6)

3 討論

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種氧化性細(xì)胞死亡,其特征是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化,并與多種疾病過程有關(guān),包括癌癥、缺血再灌注損傷、感染和神經(jīng)退行性疾病[5]。肺中的各種細(xì)胞類型,包括上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,可以產(chǎn)生鐵代謝相關(guān)蛋白,以調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài),保護(hù)肺組織免受氧化應(yīng)激[2]。鐵代謝紊亂與ARDS患者的肺組織損傷密切相關(guān)[3],即過多的鐵可以通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧和細(xì)胞毒性。臨床研究[10]表明,ARDS的嚴(yán)重程度與鐵和鐵相關(guān)蛋白的水平有關(guān)。研究[11]表明,血液制品中的鐵會(huì)導(dǎo)致受血者體內(nèi)鐵的增加,從而促進(jìn)輸血相關(guān)ALI的發(fā)生。在ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中可以檢測(cè)到Fe2+和鐵調(diào)節(jié)劑水平升高[12]。由于肺泡上皮細(xì)胞死亡可能是ARDS中肺泡損傷的一個(gè)關(guān)鍵特征,受損的AECs產(chǎn)生過量活性氧進(jìn)一步加重ARDS肺損傷[13]。因此,本研究選擇MLE12細(xì)胞作為體外研究對(duì)象。先前研究[14]表明Fer-1抑制脂質(zhì)過氧化減輕了LPS誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)LPS以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MLE12細(xì)胞活力降低、鐵死亡、氧化應(yīng)激增加,這與先前的研究一致。

眾所周知,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細(xì)胞器,對(duì)活性氧敏感。活性氧在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的持續(xù)積聚引發(fā)ERs,可能是導(dǎo)致ALI進(jìn)展的重要機(jī)制[4]。證據(jù)[3]表明,抑制ERs可以改善膿毒癥相關(guān)的肺損傷。GRP78是ERs的主要調(diào)節(jié)蛋白,ATF4在ERs中顯著上調(diào),促進(jìn)CHOP等因子表達(dá),這些因子通常被視為ERs的生物標(biāo)志物[3]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著LPS劑量的增加,GRP78、ATF4和CHOP的表達(dá)水平增加,表明LPS可以誘導(dǎo)MLE12細(xì)胞的ERs。近年來,證據(jù)[7]表明ERs增加與LPS誘導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)。FAM134B作為介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的主要受體之一,在ERs情況下,可以通過螯合進(jìn)入自噬體來介導(dǎo)ER進(jìn)入溶酶體。FAM134B可以通過其膜彎曲能力促進(jìn)膜重塑和減輕ERs破壞,并通過與LC3的結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,FAM134B的下調(diào)將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張[7]。此外,研究[15]表明,未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)可以激活FAM134B的表達(dá)以識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS激活了MLE12細(xì)胞中的ERs和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,通過上調(diào)FAM134B,減輕了LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞活力降低、鐵死亡和氧化應(yīng)激增加,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬抑制參與介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的MLE12細(xì)胞鐵死亡。此外,本研究通過體內(nèi)研究驗(yàn)證了體外發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部組織中4-HNE上調(diào)和GPX4表達(dá)抑制,伴隨著ERs激活和FAM134B水平的下降,而FAM134B預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了LPS誘導(dǎo)的這些變化。研究[7]表明,膿毒癥相關(guān)肺損傷中4-HNE超載通過上調(diào)ERs基因(如ATF4、CHOP)激活所有UPR途徑,并促進(jìn)鐵死亡。因此,上調(diào)FAM134B對(duì)于抑制ARDS病理過程相關(guān)的鐵死亡至關(guān)重要。

總之,本研究顯示LPS以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MLE12細(xì)胞鐵死亡和ERs。通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬相關(guān)FAM134B受體有助于抑制ERs,并減輕細(xì)胞鐵死亡。本研究的發(fā)現(xiàn)為LPS誘導(dǎo)的ARDS提供了新的見解,這有助于更好地理解ARDS相關(guān)病理機(jī)制,并作為尋找預(yù)防ARDS的有效策略的基礎(chǔ)。然而,本研究主要集中在FAM134B自噬受體上,不能排除其他受體以及其他形式的自噬(如鐵蛋白自噬)是否參與LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞鐵死亡,未來需要更多研究以擴(kuò)展本研究發(fā)現(xiàn)。