乙醇脫氫酶1A和血管內皮生長因子-A在肝細胞癌中的表達

薛樂樂,井玉瑩,楊凱歌,祁力文,吳 桐,任祎琳,臧翌辰,王良海,張海俊,梁偉華,胡建明

肝癌是常見的惡性消化系統腫瘤之一,其病死率位居全球高發腫瘤的第三位,預后較差[1]。盡管最近在肝癌診斷和治療方面有所突破,但多數肝癌患者在確診時均為中晚期癌,接收手術切除的患者只占20%～30%,術后5年轉移/復發率達60%～70%。雖然目前越來越多學者對肝癌發病和演進機制進行深入研究,但腫瘤復發、轉移機制仍未完全明確。目前,病毒性肝炎和飲酒是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發生的主要原因。乙醇脫氫酶1A(alcohol dehydrogenase 1A,ADH1A)作為一種酒精代謝相關的關鍵酶,與食管癌的易感性有關,能夠抑制食管癌的進展[2]。血管內皮生長因子-A(ascular endothelial growth factor-A,VEGFA)在新生血管的形成和腫瘤淋巴結轉移中發揮重要作用。但是,在HCC中ADH1A和VEGFA的相關研究較少。為進一步明確ADH1A和VEGFA在HCC進展和預后中的作用,該研究通過分析ADH1A和VEGFA在HCC中的表達情況和相關性,結合病例樣本中ADH1A和VEGFA的表達及與臨床病理參數和預后的相關性分析,探討ADH1A和VEGFA在預測HCC患者臨床進展和不良預后的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本研究回顧性收集2012年1月—2018年1月在石河子大學第一附屬醫院行手術并確診的HCC病例的臨床病理資料,選取了病例資料較為齊全的HCC組織樣本84例,所有的HCC樣本均經病理醫師確診,并按2019年WHO標準分級,入選標準如下:① 單發肝癌;② 根治性手術切除;③ 術后病理證實為HCC;另選取符合條件的HCC癌旁正常組織43例,并對所有患者通過電話及信件方式進行隨訪,隨訪時間約為1～95個月,25例失訪,總共獲得59例患者的隨訪資料,其中43例存活,16例死亡。該研究得到石河子大學第一附屬醫院倫理委員會的批準(批號:KJ2022-069-01)。

1.1.2抗體、試劑和儀器 兔抗人ADH1A(貨號:ab108203)購自英國Abcam公司;小鼠抗人VEGFA購自美國Santa Cruz公司(貨號:sc-7269);辣根酶標山羊抗兔IgG聚合物(貨號:ZB-2301)、辣根酶標山羊抗鼠IgG聚合物(貨號:ZB-2305)以及DAB顯色液(貨號:ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;EDTA抗原修復液(貨號:C1003)購自北京索萊寶科技有限公司。顯微鏡(型號:BX51TF)購自日本奧林巴斯Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化染色 將HCC石蠟切片置于60 ℃的溫箱中烤30 min,然后進行二甲苯和乙醇脫蠟水化,用枸櫞酸或EDTA進行高溫修復,冷卻后置于H2O2中10 min,PBS洗3次后4 ℃孵育一抗ADH1A(1∶1000)和VEGFA(1∶1 000)14 h,次日分別滴加二抗辣根酶標山羊抗兔IgG聚合物(1∶100)和辣根酶標山羊抗鼠IgG聚合物(1∶100),37 ℃孵育2 h,DAB顯色,顯色后水洗,蘇木精染色,酸酒精分化4～5 s,然后自來水返藍5 min,最后乙醇脫水,封片后于顯微鏡下觀察。

1.2.2免疫組化結果評定 ADH1A和VEGFA均為胞質染色,具體免疫組化評定參照之前的研究[3]。染色陽性細胞比例評分:Score1(0分:≤5%;1分:6%～25%;2分:26%～50%;3分:51%～75%;4分:76%～100%);陽性細胞染色強度:Score2(0:缺失;1:弱陽性;2:中等陽性;3:強陽性)。最終評分依據為兩者乘積,即Score1×Score2,<3分為低表達,≥3分為高表達。

1.2.3ADH1A基因富集分析以及臨床相關性分析 從腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas program,TCGA)[4]數據庫(https://cancergenome.nih.gov/)中下載了374例HCC患者和50例HCC患者癌旁的mRNA和相應的臨床數據,并且使用“limma”R pack對基因表達譜進行標準化,隨后,以KEGG和GO的基因集為參照,利用基因富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)[5]識別HCC和癌旁正常組織之間差異顯著的通路并對比HCC患者組織和癌旁組織ADH1A差異表達的時候HCC信號通路的表達差異情況,循環次數設置為1 000次,滿足P<0.05以及FDR-q<0.25時被認為有統計學意義。基于基因表達譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析了ADH1A和VEGFA的相關性。

1.3 統計學處理應用SPSS 27.0軟件進行統計分析,采用Fisher精確概率法分析ADH1和VEGFA在HCC和癌旁組織中的表達差異情況,四格表χ2檢驗分析ADH1A、VEGFA與臨床病理參數的關系;采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,采用Log-rank檢驗分析ADH1A和VEGFA蛋白表達水平與HCC的總生存率的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADH1A差異表達對基因相關通路的影響GSEA分析發現,在HCC和癌旁正常組織中的ADH1A差異表達時,基因相關通路如PPAR、NOTCH、WNT和VEGF的表達差異均有統計學意義(均FDR-q<0.250,P<0.05)。其中,VEGF(圖1A)、WNT(圖1B)、NOTCH(圖1C)通路和ADH1A呈負相關,PPAR(圖1D)和ADH1A呈正相關。

圖1 GSEA分析ADH1A在HCC中的相關通路

2.2 ADH1A和VEGFA在HCC和癌旁組織中的表達及相關性GEPIA分析發現,ADHA在HCC組織中(369例)低表達,在癌旁正常組織(50例)高表達(P<0.05)(圖2A),而VEGFA則相反(P<0.05)(圖2B)。并且在HCC中,ADH1A和VEGFA的表達呈負相關(r=-0.14,P<0.01)(圖2C)。

圖2 在線網址分析ADH1A和VEGFA在HCC和癌旁的表達和兩者的相關性

2.3 HCC組織中ADH1A和VEGFA的蛋白表達與患者臨床病理參數的相關性免疫組化染色可見ADH1A和VEGFA均在胞質中表達。癌旁正常組織中ADH1A蛋白陽性表達率為100%(43/43),84例HCC組織標本中有40例ADH1A蛋白呈陽性表達,陽性表達率為47.61%(40/84),明顯低于癌旁正常組織(χ2=33.169,P<0.001)。HCC中VEGFA陽性表達率為59.52%(50/84),高于癌旁正常組織[4.70%(2/42)](χ2=21.346,P<0.001)。見圖3。此外,HCC組織中ADH1A蛋白表達和VEGFA蛋白表達呈負相關(r=-0.22,P<0.05)。見圖4。進一步結合病例樣本的臨床病理參數分析發現,HCC組織中ADH1A高表達組的腫瘤脈管癌栓和復發的比例更低(均P<0.05),而VEGFA高表達組中腫瘤直徑>5 cm、高TNM分期、有微衛星以及G2-G3分化程度比例更高(P<0.05),見表1、2。提示HCC患者ADH1A低表達和VEGFA的高表達可能預示腫瘤的快速進展。

表1 ADH1A與HCC臨床病理參數的關系[n(%)]

表2 VEGFA表達與HCC臨床病理參數的關系[n(%)]

圖3 HCC和癌旁組織中ADH1A和VEGFA的表達 ×400

圖4 HCC組織中ADH1A與VEGFA表達的相關性分析

2.4 ADH1A的高表達與VEGFA的低表達與HCC患者預后較好有關為了進一步研究ADH1A和VEGFA的表達差異是否對HCC患者的臨床預后產生影響。本研究通過Kaplan-Meier生存分析發現,ADH1A高表達HCC患者的五年生存率高于ADH1A低表達的患者(Log rankP=0.003)(圖5A),而VEGFA的表達狀態與HCC患者的五年生存率差異無統計學意義(Log rankP=0.634)(圖5B),進一步分析了ADH1A高表達同時VEGFA低表達、ADH1A低表達同時VEGFA高表達、ADH1A高表達同時VEGFA高表達以及ADH1A低表達同時VEGFA低表達的HCC患者預后情況,結果顯示ADH1A高表達同時VEGFA低表達的五年生存率優于其他形式表達的腫瘤患者(Log rankP=0.004)(圖5C),以上圖片均為檢剔后線段。

圖5 不同ADH1A和VEGFA蛋白表達HCC患者的生存曲線

3 討論

原發性HCC有三種主要組織學類型,即HCC、肝內膽管細胞癌和混合型癌[1]。HCC占全世界原發性HCC病例的80%以上[6],在中國發病率和病死率更加嚴峻[7]。因此,深入了解HCC的危險因素并且積極探索其可能的分子機制,尋找用于HCC復發轉移的標志及有效的分子靶點對于改善HCC患者的預后與生存具有十分重要的意義。

ADH1A屬于第一類乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH),ADH由ADH1A、ADH1B、ADH1C組成[8],ADH1A對HCC發生發展的作用鮮有研究。本研究疫組化實驗檢測結果顯示,癌組織中ADH1A的蛋白表達水平較癌旁組織低,并且與患者

的復發和有無癌栓等預后相關。本研究結果與目前關于ADH1A蛋白在如HCC、結腸癌、胃癌、食管鱗癌、肺癌等惡性腫瘤中的研究結果類似[9-12]。

本研究分析了84例HCC患者的臨床病理特征,發現伴隨HCC組織中ADH1A表達的降低,患者發生脈管癌栓以及復發的比例增高。本研究Kaplan-Meier生存分析結果顯示,HCC患者ADH1A蛋白高表達較低表達患者的五年生存率高,說明ADH1A蛋白的高表達與患者良好的預后有關。Liu et al[12]發現ADH1A在HCC組織中的表達明顯低于正常肝組織,此外,ADH1A的高表達與HCC患者的良好預后相關。Mao et al[13]也發現,ADH1A抑制非小細胞肺癌細胞存活和遷移,表明ADH1A可能具有腫瘤抑制作用。上述研究與我們的研究結果相似,提示ADH1A高表達可能是HCC患者良好預后的重要評價指標之一。

VEGFA是推動腫瘤血管床擴張的主要因素之一[14]。VEGFA誘導血管通透性增加、跨細胞氣孔的形成和細胞旁連接的瞬時開放。在本研究中,VEGFA高表達,HCC腫瘤的直徑大、分化程度差,微衛星灶出現的比例也大,同時腫瘤患者的臨床分期也提升,提示VEGFA的高表達可能與HCC的快速進展有關。本研究Kaplan-Meier生存分析發現,VEGFA蛋白高表達患者五年生存率低于VEGFA蛋白低的表達患者,但沒有統計學意義,這可能和我們的樣本量相對較小有關。本研究還分析了ADH1A和VEFGA單獨表達以及兩者同時表達的作用。結果表明,ADH1A高表達同時VEGFA低表達較其他組合形式蛋白表達患者的生存率均高,提示ADH1A高表達同時VEGFA低表達可以作為HCC患者較好預后評估的重要參考指標之一。