淋巴細胞亞群聯合趨化因子對兒童原發免疫性血小板減少癥診斷價值研究

沈晨濤,夏亞林,盛燁萍,褚培培,李建琴

原發免疫性血小板減少癥(immunologic thrombocytopenic purpura,ITP)也稱特發性血小板減少性紫癜,該病是一組以血小板生成減少、清除率增加為表現的出血性疾病,在兒童中高發,尤其以4～6歲兒童較為常見,該病發病率約8.4人/10萬[1-2]。目前ITP的診斷仍基于臨床排除法和骨髓穿刺等實驗室檢查,在排除其他原因所致血小板減少后,才能確診為ITP,骨髓穿刺可對機體造成創傷,不適用于早期篩查[3],因此有必要采取其他方法以篩查ITP。雖然ITP的發病機制尚未完全明確,但現有的研究[4]證明血小板生成抑制及血小板破壞是引起血小板減少的直接原因,輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2(helper T cells 1/helper T cells 2,Th1/Th2)相關趨化因子的異常表達在ITP患者免疫異常中發揮了重要作用,可能是ITP的發病因素之一;另有研究[5]發現ITP患兒自身抗原的異常表達所引起自身反應性T淋巴細胞亞群被激活,促進體內血小板抗體分泌也可能是ITP發生的原因之一。該研究選擇淋巴細胞亞群及趨化因子進行分析,探討上述指標聯合檢測對兒童ITP診斷價值,以期為兒童ITP的早期篩查診斷提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 將2021年1月—2023年2月蘇州市吳江區兒童醫院與蘇州大學附屬兒童醫院接診的132例擬診為ITP的患兒納入本次研究。納入標準:① 有不同程度的出血表現;② 經連續2次以上檢血小板計數(blood platelet,PLT)<100×109/L;③ 無血小板減少癥相關治療史;④ 年齡在14歲及以下;⑤ 研究對象家屬已簽署知情同意書。排除標準:① 采血前1個月內有免疫抑制劑治療史的患者;② 近1個月內有疫苗接種史或輸血史的患者;③ 人類免疫缺陷病毒感染者;④ 繼發性血小板減少癥患者。

1.1.2主要試劑和儀器 CD4、CD8及CD3單克隆抗體[法國 IMMUNOTECH S.A.S(美國貝克曼庫爾特有限公司法國分公司)],貨號:A07752、A07758、A07749);流式細胞分析用溶血素(美國碧迪生物科學公司,貨號:349202);PBS緩沖液(北京百奧萊博生物科技有限公司,貨號QP0342);人CC類趨化因子配體5(chemokine (C-C motif) ligand 5,CCL5)、人單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1) ELISA試劑盒(上海臻科生物科技有限公司,貨號:ZK-1781、ZK-0748)、人CC類趨化因子配體11[recombinant chemokine (C-X-C motif) Ligand 1,CXCL11]ELISA試劑盒(上海禹紹生物科技有限公司,貨號:YS-F11805)。多功能酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:Multiskan FC);流式細胞儀(美國BD公司,型號:FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1淋巴細胞亞群及趨化因子的檢測 取患兒空腹外周血6 ml,分2管。其中1管1 ml置含EDTA抗凝劑試管中,避光孵育熒光標記的CD4、CD8及CD3單克隆抗體20 min后加入溶血素繼續孵育8 min,PBS洗滌、離心2次(3 000 r/min,15 min)后重懸,以流式細胞儀對CD4+、CD8+及CD3+水平進行檢測。另1管5 ml,置無菌Eppendorf試管中,以3 000 r/min冷凍離心15 min后分取血清,以酶聯免疫吸附法對CCL5、CXCL11、MCP-1水平進行檢測,操作均專業人員按試劑盒說明書進行。

1.2.2ITP的診斷 參照《諸福棠實用兒科學(第8版)》[6]兒童ITP的診斷標準:>2次血常規檢測顯示PLT<100×109/L,無脾臟增大表現或僅輕度增大,骨髓穿刺檢查顯示巨核細胞增多或正常,排除自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等其他繼發性血小板減少癥。根據上述標準診斷結果將患兒分為ITP組與非ITP組。

2 結果

2.1 ITP組與非ITP組一般資料比較本次納入的患兒中男72例,女60例;年齡4～14歲,平均(6.13±1.74)歲;BMI指數18.92～24.17 kg/m2,平均(21.33±3.04)kg/m2。132例患兒中確診為ITP共88例,44例非ITP組患者中再生障礙性貧血30例,急性白血病14例。ITP組與非ITP組患者性別、年齡、BMI指數及PLT水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 ITP組與非ITP組一般資料的比較

2.2 ITP組與非ITP組淋巴細胞亞群及趨化因子水平比較ITP組患者CD4+、CD3+淋巴亞群比率均低于非ITP組,CD8+淋巴亞群比率、CCL5、CXCL11、MCP-1水平均高于非ITP組(均P<0.01)。見表2。

表2 ITP組與非ITP組淋巴細胞亞群及趨化因子水平比較

2.3 ITP組患者淋巴細胞亞群和趨化因子與PLT相關性分析結果相關性分析結果顯示ITP組患者CD4+、CD3+與PLT呈正相關,CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1與PLT呈負相關關系(均P<0.05)。見表3。

表3 ITP組患者淋巴細胞亞群聯合趨化因子與PLT相關性分析

2.4 ROC分析結果ROC分析結果顯示,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1對兒童ITP診斷的截斷值分別為27.13%、24.02%、59.88%、41.02 ng/L、30.18 ng/L和188.27 ng/L,AUC分別為0.893、0.880、0.629、0.801、0.892和0.751,六者并聯診斷(指并聯檢測時CD4+、CD3+中的一項及以上低于截斷值和/或CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1中的一項及以上高于截斷值)的AUC為0.967,其診斷效能高于各指標單獨檢測(Z=2.011、2.164、4.521、2.286、2.012、2.788,P=0.044、0.030、0.000、0.022、0.044、0.005)。見圖1、表4。

圖1 淋巴細胞亞群聯合趨化因子診斷ITP的ROC曲線

表4 淋巴細胞亞群聯合趨化因子診斷ITP的ROC分析

3 討論

ITP為自發性出血性疾病的一種,兒童出血性疾病中ITP占比較高[7],臨床實踐中發現ITP較多具有自限性,病程多為4～6周,但較大齡的兒童及青少年中患有慢性ITP的可能性更高[8]。ITP發病機制目前尚不明確,但研究[9]表明免疫應答紊亂與該病的發生密切相關,細胞免疫及體液免疫異常均有可能誘發ITP,尤以細胞免疫異常較為常見。T淋巴細胞亞群檢測在臨床中常用于自身免疫疾病、血液疾病、變態反應性疾病的輔助診斷;趨化因子在細胞遷移、細胞凋亡調控、白細胞聚集及細胞因子產生等方面發揮重要作用,同時還在多種疾病的發生中起關鍵作用[10]。

正常情況下,CD4、CD8等T淋巴細胞間相互制約并誘導形成T細胞網絡,對于維持機體免疫內環境穩定具有重要的意義。本研究結果顯示,ITP組患者CD4+、CD3+淋巴亞群比率均低于非ITP組,CD8+淋巴亞群比率高于非ITP組,與先前的研究相一致[11]。CD4+為免疫反應中起主要反應的T細胞,并有增強、擴大其他免疫細胞作用的功能,因而CD4+水平下降意味著患兒的免疫功能下降;CD8+則具有抑制T細胞活化及B細胞抗體產生的作用,其水平升高反而預示著患兒的免疫功能降低[12]。本研究進一步經相關性分析結果顯示,ITP組患者PLT與CD4+、CD3+呈正相關關系,與CD8+呈負相關關系;考慮可能與ITP患兒CD4+、CD3+淋巴亞群比率下降,CD8+淋巴亞群比率升高使機體中參與免疫反應的細胞隨之下降,導致機體免疫平衡被破壞進而影響機體免疫功能,進一步導致自身反應性T細胞被激活,引起B細胞活化、增殖并產生相應抗體,引起細胞、體液免疫異常破壞血小板有關[13]。

在ITP發病過程中免疫細胞的異常分化需經血小板的趨化運動才可發揮相應的生物學效應。本研究發現,ITP組患者CCL5、CXCL11和MCP-1水平均高于非ITP組,CCL5為趨化因子受體CCR5的高親和力配體,CXCL11則為CXCR3受體高親和力配體。研究[14]發現上述兩種受體均在Th1細胞表面高表達,CCL5、CXCL11可通過與相應受體結合而引起Th1細胞紊亂,引起自身反應性B細胞分泌抗血小板抗體進而破壞血小板。MCP-1為單核巨噬細胞的趨化因子,其可通過提高單核巨噬細胞活性而破壞血小板[15]。本研究相關性分析結果顯示,CCL5、CXCL11和MCP-1與血小板計數呈負相關,可能與隨著CCL5、CXCL11和MCP-1水平的升高,其介導的Th1細胞、單核巨噬細胞趨化運動更強,增強了Th1細胞及單核巨噬細胞對血小板破壞作用有關。

本研究進一步ROC分析結果顯示,六者并聯診斷的診斷效能高于各指標單獨檢測,可能與不同指標僅能反映各自的部分功能有關,而并聯檢測可將不同指標所反映的機體狀況整合,使診斷效能更高。需要注意的是,本研究結果仍需結合血常規、臨床診斷指標才能起到最佳的篩查效果,兒童ITP確診仍需行骨髓穿刺,本研究結果可用于提高早期篩查敏感度,在出血癥患兒中精準識別出ITP高風險人群,減少不必要的骨髓穿刺檢查。

綜上所述,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1均可用于兒童ITP的診斷,各指標并聯檢測可提高檢測效能。因本研究僅對比了ITP與再生障礙性貧血、急性白血病等非ITP患兒的上述指標,未設置健康兒童作為對照,后續的研究中將增加指標、增加中心、擴大樣本量,并增設健康對照組以進一步證實本研究結果。