電針對硝酸甘油致偏頭痛小鼠疼痛行為及三叉神經血管系統的影響

徐曉白,張若滔,王雪飛,溫雅麗,王握瑜,劉 璐,趙洛鵬,李志娟,王麟鵬,郭 靜,李 彬

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院針灸中心/針灸神經調控北京市重點實驗室,北京 100010)

偏頭痛是一種原發性頭痛疾病,具有反復發作的特點,疼痛程度以中重度為主,影響了世界上15%以上的最具生產力的成年人[1]。目前認為偏頭痛是神經血管性腦功能失調所致[2],主要表現為單側或雙側的搏動樣疼痛,伴隨惡心和嘔吐,活動后加重[3]。長時間高頻率的偏頭痛反復發作會導致面部乃至全身的痛覺敏化,嚴重影響患者的生活質量。偏頭痛急性發作的一線治療藥物是非甾體類抗炎藥、曲坦類、降鈣素基因相關肽(CGRP)受體拮抗劑及高選擇性5-羥色胺1F受體激動劑,慢性偏頭痛一線預防性藥物是A型肉毒毒素、抗癲癇藥、β受體阻滯劑、抗抑郁藥、鈣離子拮抗劑等,但這些藥物治療效果有限,不能滿足臨床需要[4]。近些年國際上大量高質量臨床研究提示,針刺可有效治療偏頭痛及預防其復發,減輕偏頭痛發作程度等,有望成為國際上公認的偏頭痛預防性治療策略之一[5-7]。但其作用機制目前尚不明確,阻礙了其進一步國際傳播和影響力擴大。另外目前大多以大鼠制備偏頭痛模型進行針刺鎮痛機制研究,但大鼠因其本身特點其基因改造較為復雜繁瑣。因此本研究以小鼠制備硝酸甘油反復注射致慢性偏頭痛模型,探究電針鎮痛的作用及其機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠20只,體重21～25 g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物證號:SCXK(京)-2020-0004。將小鼠單籠飼養,室溫(24±1)℃,濕度(50±10)%,明暗循環12 h,隨意進食和飲水。實驗設計經北京中醫藥研究所動物實驗倫理委員會批準,實驗操作遵循國際有意識動物疼痛研究協會建議。

1.2主要試劑及儀器 硝酸甘油 (北京益民制藥有限公司,國藥準字 H11020289);珞亞山川針灸針(固始公元醫療器械有限公司,豫械注準20172270468,0.13 mm×13 mm) ;生理鹽水;足底疼痛檢測鋼架(北京金冠卓藝商貿有限公司,規格:120 cm×35 cm×40 cm);開放式小鼠固定架(北京金冠卓藝商貿有限公司,規格:10 cm×10 cm×10 cm);自制小鼠固定筒(北京金冠卓藝商貿有限公司,規格:25 mm×100 mm);韓氏多功能電針治療儀(南京濟生醫療科技有限公司,HANS-200);冰凍切片機(德國Leica,CM3050S);Von Frey纖維絲(Semmes-Weinstein Monofilaments;Stoelting Co.,Wooddale,IL,USA,58011);冷熱板測痛儀(濟南益延科技發展有限公司,YLS-21A);可調式微量移液器(德國 eppendorf);倒置熒光顯微鏡(德國蔡司,IMAGERZ2);全功能酶標儀(美國伯騰公司,Biotek SynergyTMH1);氣麻機(深圳瑞沃德生命科技有限公司,68058);防脫載玻片、蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司);Anti-c-Fos抗體(CST,美國,2250);Anti-NeuN antibody[1B7]-Neuronal Marker(ABCAM,英國,ab104224);小鼠降鈣素基因相關肽(CGRP)ELISA試劑盒(華美,CSB-EQ02770MO);小鼠一氧化氮(NO)ELISA試劑盒(賽培生物,SP14504);牛血清白蛋白(索萊寶,A8020);封閉山羊血清(索萊寶,S9070);Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技術有限公司,A0423);Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天生物技術有限公司,A0473);抗熒光衰減封片劑(含DAPI)(索萊寶,S2110);β-actin(普利萊,C1313);辣根過氧化酶標記的山羊抗兔(普利萊,C1309);辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠(普利萊,C1308)。

1.3實驗方法 將適應性喂養1周的小鼠隨機分為對照組、模型組、假針組、電針組,每組5只。參考文獻[8]方法,于實驗第1,3,5,7,9,11,13天,模型組、電針組、假針組小鼠給予10mg/kg硝酸甘油(5 mg/mL硝酸甘油原液含有30%乙醇、30%丙二醇及水,用 生理鹽水稀釋成1 mg/mL,現配現用)腹腔注射建立慢性偏頭痛模型,對照組給予等體積對照溶液(含有30%乙醇、30%丙二醇及水的等體積溶劑2 mL,用生理鹽水稀釋成10 mL的溶液)腹腔注射,均1次/d。在每次注射后30 min,電針組和假針組進行電針干預。電針組取穴參照 《實驗針灸學》[9],取小鼠雙側風池穴(GB20,頸后枕骨下,胸鎖乳突肌和斜方肌之間凹陷,距離兩耳連線中心約3 mm處),進針2～3 mm,連接韓氏多功能電針儀,疏密波2/15 Hz,0.5～1 mA,強度以小鼠耳郭輕度抖動為度,刺激15 min;假針組取穴參照前期實驗取穴方案[10-11],在雙側髂棘前1 cm處進針約2 mm,連接韓氏多功能電針儀,疏密波2/15Hz,0.5～1 mA,強度以局部肌肉收縮為度,刺激15 min。 在最后一次注射后,繼續觀察小鼠行為學至第14天并進行取材。以腹腔注射后5 min,小鼠出現理毛、耳紅、爬籠、畏光畏聲等行為為偏頭痛造模成功。

1.4檢測指標及方法

1.4.1行為學檢測 于實驗開始前2 d、實驗當天(第0天)注射前及實驗第2,4,6,8,10,12,14天分別檢測小鼠眶周機械痛閾及后足機械痛閾、熱痛痛閾(實驗開始前2 d檢測為行為學適應,取第0天的測試結果作為基線數值)來判斷模型構建情況及電針治療的有效性。所有測試均在小鼠清醒和自由移動情況下進行,不應用任何鎮靜及鎮痛劑,行為學評估人員對實驗設計不知情。

1.4.1.1眶周機械刺激實驗 實驗前30 min,將小鼠放在13 cm×28 cm×13 cm籠中預適應。將0.4 g的Von Frey絲以大約90°角施加于眼側和中線附近的眶周區域12次,記錄Te反應并評分(單前爪或雙前爪劃過面部評1分,刺激后攻擊/咬von Frey絲或頭部明顯從刺激中抽離評0.25分),12次測試累積總分即為眶周機械刺激反應評分[12]。

1.4.1.2后足機械刺激實驗 將小鼠置于2 mm×2 mm孔隙的金屬網格上,并用大小相同的有機玻璃盒隔開各小鼠,待小鼠適應環境30 min、不再四處張望后,參照文獻[13]方法,使用Von Frey絲測量小鼠后足的機械痛閾值。操作方法:使用Von Frey絲緩慢輕柔地刺激小鼠的左側后足足底中部,持續幾秒觀察小鼠的縮足反應。刺激強度從0.16 g開始(最大刺激強度為2 g),若纖維絲彎曲超過90°時小鼠仍不抬足則視為無反應,換用相鄰的刺激強度大一級的纖維絲刺激,超過2 g仍無反應則予以剔除;如果有反應,則更換相鄰的刺激強度小一級的纖維絲。每次刺激時間間隔必須大于10 s,直到找到能引起50%抬足反應的纖維絲,記錄為50%撤退閾值。

1.4.1.3后足熱痛刺激實驗 參照文獻[14]中方法, 將待測小鼠置于YLS-21A冷熱板測痛儀的有機玻璃罩中適應30 min,待小鼠安靜后,將熱板溫度設置為52 ℃,通過熱源刺激小鼠足底部,小鼠出現舔后足、原地跳躍或明顯縮腿等行為為反應陽性,熱痛儀自動切斷電源,并記錄為小鼠后足的熱痛撤退潛伏期,15 s內未舔足則手動切斷電源,并將此小鼠排除。每只小鼠連續記錄3次,每次間隔10 min,取3次測量的平均值。測量過程保持有機玻璃罩內干燥,以免影響測量結果。

1.4.2血清NO和CGRP水平 實驗第14天行為學檢測結束后,麻醉各組小鼠,眶周取血,靜置后4 ℃下3 000 r/min離心20 min,獲取上清液,儲存在-80 ℃冰箱,按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.4.3三叉神經節中c-Fos蛋白陽性表達情況采用免疫熒光染色法檢測:取經4%多聚甲醛固定過的三叉神經節,采用20%～30%蔗糖梯度脫水(PBS溶解)后包埋、切片(厚10 μm)、干燥,PBS溶液洗滌2～3次,在含0.15%曲拉通的PBS中孵育30 min透膜,在5%牛血清白蛋白(BSA)和10%正常山羊血清中封閉1h;加入Anti-c-Fos抗體(1∶1 000)、Anti-NeuN antibody[1B7]-Neuronal Marker(1∶1 000)在4 ℃冰箱中孵育過夜;次日PBS溶液洗滌3～5次后,加入Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育;經PBS洗滌2～3次后,用抗熒光衰減封片劑封片。使用Image J軟件分析圖像(V 1.51),計算c-Fos陽性表達平均光密度。

1.4.4三叉神經節中c-Fos蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:取小鼠三叉神經節組織,采用裂解液裂解,離心收集上清液,使用BCA法測定蛋白濃度;通過凝膠電泳分離蛋白、轉膜,室溫下用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h,然后加入兔抗Anti-c-Fos抗體 (1∶1 000)4 ℃下孵育過夜(使用內參抗體β-actin 1∶1 000做對照);第 2天洗膜后在室溫下用辣根過氧化酶標記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)孵育1.5 h;使用化學發光系統顯色,用Image J軟件對蛋白質條帶進行半定量分析。

1.5統計學方法 所有數據采用SPSS 18.0軟件分析。行為學評價數據采用兩因素重復測量方差分析,其他數據采用單因素方差分析,組間比較用事后檢驗中的Bonferroni檢驗(方差相等)或Tamhane檢驗(方差不等);當處理因素與時間因素存在交互作用時,則改用單一時間點的單因素方差分析。單因素方差分析中,當檢驗變量不服從正態分布時,采用多個獨立樣本的非參數檢驗中的Kruskal-Wallis檢驗,當各組存在差異時再用兩個獨立樣本的非參數檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠眶周機械刺激反應評分比較 除對照組外,其他組小鼠眶周機械刺激反應評分隨著時間延長逐漸增高[F(2.138,8.550)=81.01,P<0.001];各組間小鼠眶周機械刺激反應評分比較差異有統計學意義[F(1.618,6.471)=38.28,P<0.001];干預和時間在眶周機械刺激反應評分中有交互作用[F(3.009,12.04)=9.442,P=0.002]。實驗第6,8,10,12,14天,模型組小鼠的眶周機械刺激反應評分均明顯高于同期對照組(P均<0.05),與假針組比較差異均無統計學意義(P均 >0.05);實驗第10,12,14天,電針組小鼠的眶周機械刺激反應評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05),且電針組小鼠實驗第12,14天的眶周機械刺激反應評分均明顯低于同期假針組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 對照組和偏頭痛各組小鼠不同時間點眶周機械刺激反應評分比較

2.2各組小鼠后足機械刺激50%撤退閾值比較除對照組外,其他組小鼠后足50%撤退閾值隨著時間延長逐漸降低[F(1.754,7.015)=35.24,P<0.001];各組間小鼠后足50%撤退閾值比較差異有統計學意義[F(1.982,7.930)=10.46,P=0.006],干預和時間在后足50%撤退閾值中有交互作用[F(3.143,12.57)=3.636,P=0.042]。實驗第8,10,12,14天,模型組小鼠的后足50%撤退閾值均明顯低于同期對照組(P均<0.05),與假針組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);實驗第10,12,14天,電針組小鼠的后足50%撤退閾值均明顯高于同期模型組(P均<0.05),且電針組小鼠實驗第12,14天的后足50%撤退閾值明顯高于同期假針組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和偏頭痛各組小鼠不同時間點后足機械刺激50%撤退閾值比較

2.3各組小鼠后足熱痛撤退潛伏期比較 除對照組外,其他組小鼠后足熱痛撤退潛伏期隨著時間延長逐漸縮短[F(2.055,8.221)=31.45,P=0.000 1];各組間小鼠后足熱痛撤退潛伏期比較差異有統計學意義[F(1.171,4.683)=19.79,P=0.007 1];干預和時間在后足熱痛撤退潛伏期中無交互作用[F(21,84)=2.731,P>0.05]。實驗第8,10,12,14天,模型組小鼠的后足熱痛撤退潛伏期均明顯短于同期對照組(P均<0.05),與假針組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);實驗第8,10,12,14天,電針組小鼠的后足熱痛撤退潛伏期均明顯長于同期模型組(P均<0.05),且電針組小鼠實驗第12,14天的后足熱痛撤退潛伏期均明顯長于同期假針組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和偏頭痛各組小鼠不同時間點后足熱痛撤退潛伏期比較

2.4各組小鼠血清NO和CGRP水平比較 模型組、假針組血清NO和CGRP水平均明顯高于對照組(P均<0.05),模型組與假針組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);電針組血清NO和CGRP水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且電針組血清NO水平明顯低于假針組(P<0.05),電針組血清CGRP水平與假針組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 對照組和偏頭痛各組小鼠血清NO及CGRP水平比較

2.5各組小鼠三叉神經節中c-Fos蛋白表達情況模型組和假針組三叉神經節中c-Fos陽性表達平均光密度和c-Fos蛋白相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.05),模型組與假針組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);電針組三叉神經節中c-Fos陽性表達平均光密度和c-Fos蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05),但與假針組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 對照組和偏頭痛各組小鼠三叉神經節中c-Fos/Neuron共染免疫熒光及c-Fos蛋白表達情況

3 討 論

偏頭痛的中醫病名為“頭偏痛”“首風”“腦風”“厥逆頭痛”“偏頭風”等,明代王肯堂《證治準繩雜病》記載:“偏頭風,頭半邊痛者是也。”《靈樞》中記載:“厥頭痛,項先痛,腰脊為應,先取天柱,后取足太陽。厥頭痛,頭痛甚,耳前后脈涌有熱,瀉出其血,后取足少陽。”可見針灸治療偏頭痛歷史悠久,治療選穴根據偏頭痛的證候和癥狀各不相同。風池作為祛風要穴,是治療偏頭痛的常用穴及有效穴,多個臨床及基礎實驗也明確了電針風池治療偏頭痛的有效性[10,15],但作用機制不明。

硝酸甘油是治療心絞痛的常用藥物,其不良反應之一就是誘發延遲性的偏頭痛發作[15-16],并多具有中重度、搏動樣疼痛及畏光畏聲等發作特點[17]。Tassorelli團隊首次將硝酸甘油用于動物實驗,結果發現硝酸甘油給藥后大鼠出現畏光、撓頭等行為,并且在偏頭痛相關的腦區出現c-Fos激活,硬腦膜中CGRP釋放增加[18]。不僅如此,硝酸甘油反復腹腔注射導致小鼠偏頭痛模型具有穩定可復制的特點。故本研究選擇反復硝酸甘油腹腔注射方法構建小鼠慢性偏頭痛模型,經行為學檢測證實該方法可成功復制偏頭痛模型,而電針干預可明顯改善偏頭痛小鼠的疼痛行為。

c-Fos是一個含有380個氨基酸的蛋白質,參與神經元對刺激的響應和適應過程,在神經元受到激活后,其表達量會在幾分鐘內快速上調。因此,c-Fos可以作為疼痛相關行為的生物標志物,可反映痛覺敏化的程度和三叉神經血管系統的活化情況[19]。CGRP是一種神經肽,參與了偏頭痛的神經源性炎癥過程,可通過激活三叉神經血管系統,促進血管活性物質的釋放,而隨著炎癥的反復持續激活,三叉神經元敏化,刺激閾值降低,對刺激反應增加,即外周敏化,這種敏化現象會擴散到三叉神經脊束核的神經元及丘腦,引起中樞敏化,這是偏頭痛進展的重要臨床表現。不僅如此,高影響力的臨床研究已經證明在自發性以及硝基血管擴張劑誘發的偏頭痛發作期間,血漿CGRP水平明顯升高[20]。另外偏頭痛的發生與NO釋放增加,導致血管擴張,引起三叉神經血管系統功能障礙有關。本實驗結果顯示,模型組血清NO、CGRP水平和三叉神經節中c-Fos陽性表達平均光密度和c-Fos蛋白相對表達量均明顯增高,電針組上述各指標均明顯低于模型組,且電針組血清NO水平明顯低于假針組,提示電針可明顯改善三叉神經血管功能。

綜上所述,電針能明顯改善反復硝酸甘油腹腔注射所致慢性偏頭痛小鼠的疼痛行為,拮抗偏頭痛模型小鼠的痛覺敏化形成,其作用機制可能與降低血清NO、CGRP水平及下調三叉神經敏化蛋白c-Fos的表達,從而改善三叉神經血管功能障礙有關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。