基于MAPK信號通路探討荔枝核總黃酮對HSC-T6細胞的作用

司馬玲,梁瀞云,龔俊文,羅偉生

(1. 廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530000;2. 廣西中醫藥防治醫學分子生物重點實驗室,廣西 南寧 530000;3. 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院,廣西 南寧 530000)

肝纖維化是由于飲酒、病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎或膽汁淤積性肝病等各種慢性肝病遷延不愈,導致慢性肝損傷所引起的反應[1],是一種肝內結締組織異常增生的病理過程。肝臟經過長期反復的炎癥刺激,可導致細胞外基質(ECM)的異常增生,形成纖維瘢痕,經久不愈,最終可演變成肝硬化甚至肝癌[2]。所以,抑制肝星狀細胞(HSC)的活化,減少ECM的形成是抑制肝纖維化進程的關鍵因素[3]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介導與多種細胞活動相關的細胞內信號傳導的絲氨酸-蘇氨酸激酶,可分為細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和ERK5,這些級聯由MAPK、MAPKK和MAP3K的三層蛋白激酶的核心模塊及MAP4K和MAPKAPK兩個附加層組成[4]。這些級聯之間相互協同作用,從而調節細胞的增殖、分化、存活和轉化[5]。荔枝核為荔枝干燥成熟的種子,其有效成分包括黃酮類、多糖類、甾體類、鞣質類、揮發油、氨基酸等[6]。本課題組前期研究表明,荔枝核黃酮類活性成分荔枝核總黃酮可促進HSC凋亡,改善肝組織病變程度,其可以通過調節多種蛋白和信號轉導通路來控制肝纖維化的發展[7-12],但其作用機制仍未明確。本研究從MAPK信號通路角度出發,探討了荔枝核總黃酮抗肝纖維化的作用機制,以為肝纖維化的治療提供新的思路與靶點。

1 實驗材料與方法

1.1實驗細胞系及藥物 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自武漢普諾賽生命科技公司(CL-116)。荔枝核總黃酮由廣西中醫藥大學藥學院提供(純度50%),秋水仙堿為Sigma公司產品(批號:SLBP0415V)。

1.2實驗試劑 CCK-8(Dojindo公司,NU680),電鏡固定液(Servicebio公司,批號:G1102),2*SYBR Mixture 熒光定量試劑盒(北京天根公司,批號:FP-205-2),Trizol(Invitrogen公司,批號:Cat# 15596-026),二甲苯、異丙醇及氯仿(天津永大試劑公司),DAB(福建邁新),PV-6000、蘇木素染色液、分化液和返藍液(北京中杉金橋公司),ELISA大鼠基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)試劑盒(CUSABIO公司,貨號:CSB-E07411r), ELISA大鼠Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)試劑盒(CUSABIO公司,貨號:CSB-E08084r),ELISA大鼠Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)試劑盒(CUSABIO公司,貨號:CSB-E07924r),磷酸化JNK抗體(p-JNK)抗體(ABCAM公司,貨號: AB124956),JNK抗體(SANTACRUZ公司,貨號:AB17946),p38抗體(ABCAM公司,貨號:AB31828),磷酸化p38(p-p38)抗體(Affinity公司,批號:AF4001),ERK抗體(ABCAM公司,貨號:AB184699),磷酸化ERK(p-ERK)抗體(ABCAM公司,貨號:AB76299)。

1.3實驗儀器 超薄切片機(Leica公司, Leica UC7),透射電子顯微鏡(HITACHI公司,HT7800/HT7700),熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司, CFX ConnectTM),核酸蛋白定量儀(美國Denovix公司,DS-11),全波長酶標儀(ThermoFisher scientific公司,型號:1510),電熱恒溫培養箱(eppendorf公司, Centrifuge 5804R),電熱恒溫培養箱(蘇州威爾實驗用品有限公司,DNP-9052),超微量紫外可見光分光光度儀(Thermo scientific公司,NanoDrop2000),PCR循環儀(eppendorf公司,Mastercycler Nexus型)。

1.4檢測指標及方法

1.4.1HSC-T6細胞增殖情況 采用CCK-8法檢測:將HSC-T6細胞置于37 ℃、0.05%的CO2孵育箱中,使用含10% FBS的DMEM培養基進行培養,取對數生長期的細胞,調整細胞濃度為1×104/mL,加入96孔板,每孔200 μL,孵育24 h。設置荔枝核總黃酮20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL組和細胞對照組、空白組,每組4個復孔。各組于孵育箱中培養72 h后,加入CCK-8孵育,觀察酶標儀在450 nm處吸光度,計算荔枝核總黃酮各組細胞增殖抑制率,選擇細胞半數抑制濃度(IC50)為最佳實驗濃度,結果顯示荔枝核總黃酮的IC50為160 μg/mL。隨后設置荔枝核總黃酮組、秋水仙堿組、細胞對照組和空白組,每組4個復孔,分別加入160 μg/mL 荔枝核總黃酮、2.5 μmol/L秋水仙堿和細胞完全培養基各200 μL,各組于孵育箱中分別培養24 h、48 h、72 h后,加入CCK-8,觀察酶標儀在450 nm處吸光度,計算荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=[1-(吸光度藥物組-吸光度空白組)/(吸光度細胞對照組-吸光度空白組)]×100%。

1.4.2HSC-T6細胞超微結構 取對數生長期的HSC-T6細胞,胰酶消化離心,接種于T25細胞瓶,于37 ℃、0.05%的CO2孵育箱中孵育24 h。將細胞分成荔枝核總黃酮組、秋水仙堿組、細胞對照組,荔枝核總黃酮組、秋水仙堿組分別加入以DMEM完全培養基稀釋的160 μg/mL 荔枝核總黃酮、2.5 μmol/L秋水仙堿,72 h后棄舊培養基,洗滌2次,胰酶消化離心,生理鹽水洗1遍,做好標記。收集各組細胞,加入電鏡固定液重懸固定2～4 h,瓊脂糖預包埋,1%鋨酸后固定,梯度乙醇脫水后丙酮與812包埋劑滲透包埋,烤箱聚合,超薄切片,鉛-鈾染色,在透射電鏡下觀察 細胞超微結構。

1.4.3HSC-T6細胞中MMP-2、Col-Ⅰ、Col -Ⅲ水平 取按照“1.4.2”分組培養的HSC-T6細胞,嚴格按ELISA試劑盒步驟操作,檢測各組細胞中MMP-2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平。

1.4.4HSC-T6細胞中JNK、ERK、p38 mRNA表達情況 采用RT-PCR法檢測:取出按照“1.4.2”分組培養的HSC-T6細胞,置于冰上,使用1 mL PBS清洗1遍,每孔加入1 mL Trizol,用細胞刮將細胞刮落,再使用槍頭輕輕吹打混勻,冰上裂解15 min,吸至準備好的EP管中,加入200 μL氯仿,劇烈震蕩10 min后靜置5 min,于4 ℃、12 000 r/min 下離心15 min,取400 μL上清液至新的EP管中,加入500μL異丙醇,充分混勻,靜置10min,再4℃、12 000 r/min 離心10 min,去除上清液,加入1 mL洗滌液(75%無水乙醇+25%無酶水),充分洗滌RNA, 4 ℃、7 500 r/min 離心10 min,冰上去上清液,開蓋干燥5 min后加入適量無酶水,手動混勻,瞬離10s,測RNA濃度。根據反轉錄試劑盒進行反轉錄,進行RT-PCR檢測,擴增條件:95 ℃ 15 min,95 ℃ 10 s,53～58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共計40個循環,在60～95 ℃繪制溶解曲線,以β-actin為內參,采用2-△△CT法進行目的基因相對定量分析。引物序列見表1。

表1 各基因的PCR引物序列

1.4.5HSC-T6細胞中MAPK相關蛋白表達情況采用免疫組化法檢測:收集按照“1.4.2”分組培養的HSC-T6細胞,滴加至蓋玻片上制作細胞爬片,細胞爬滿后,洗去培養液,冷丙酮固定15 min。向爬片上滴加Triton通透液20 min,PBS洗5 min×3次,滴加3%雙氧水,室溫孵育20 min,再次PBS清洗,滴加5%BSA封閉20 min,爬片上滴加JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38 一抗4 ℃過夜,次日待爬片恢復至室溫后,PBS洗5 min×3次,滴加二抗,37 ℃避光20 min后,再次PBS清洗,DAB顯色液顯色至有棕色陽性著色后終止顯色,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。每張切片隨機選擇拍攝3個視野(×100),以有棕黃色或棕黑色顆粒為陽性,以藍紫色或不著色為陰性,使用 Image J軟件進行免疫組化數據分析,以陽性區域累積光密度值和表達面積比值為平均光密度值。

2 結 果

2.1各組細胞增殖抑制率 荔枝核總黃酮20 μg/mL和40 μg/mL組的吸光度與細胞對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05),荔枝核總黃酮20 μg/mL和40 μg/mL組的細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05);荔枝核總黃酮80μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL組的吸光度均明顯低于細胞對照組(P均<0.05),此3個藥物組的細胞增殖抑制率均明顯高于荔枝核總黃酮20 μg/mL和40 μg/mL組(P均<0.05),且呈劑量依賴性增高,兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05);當荔枝核總黃酮濃度為160 μg/mL時達到IC50濃度,故采用荔枝核總黃酮160 μg/mL為后續藥物實驗濃度。后續實驗中,荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組培養24 h、48 h、72 h后的吸光度均明顯低于細胞對照組(P均<0.05);干預24 h后,荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組細胞增殖抑制率比較差異無統計學意義(P>0.05);干預48 h、72 h后,荔枝核總黃酮組細胞增殖抑制率均明顯高于秋水仙堿組(P均<0.05);當荔枝核總黃酮干預72 h時達到IC50濃度,故采用荔枝核總黃酮干預72 h為藥物干預時間。見表2及表3。

表2 各組HSC-T6細胞培養72h后細胞吸光度與增殖抑制率比較

表3 各組HSC-T6細胞培養不同時間后細胞吸光度與增殖抑制率比較

2.2各組細胞透射電鏡下形態 細胞對照組HSC-T6細胞生長良好,細胞體積大,形態不規則,細胞膜完整清晰,表面富含纖毛結構,細胞質向四周伸展呈星形,與鄰近細胞和組織相互銜接,胞內富含脂滴,細胞器與細胞核清晰可辨,線粒體呈圓形和桿形,可見線粒體嵴,細胞核內染色均勻;荔枝核總黃酮組HSC-T6細胞之間間隙變大,細胞膜四周纖毛脫落,膜表面不平整,細胞漿內線粒體明顯變形,線粒體嵴斷裂或消失,部分線粒體呈空泡狀,粗面內質網扁池擴張,附著的核糖體脫粒,細胞核內染色質濃縮凝結,部分染色質邊聚,核膜皺縮,可見凋亡小體形成;秋水仙堿組細胞核膜皺縮變形,染色質明顯濃縮邊聚,胞質內可見大量線粒體崩解成空泡狀,細胞膜呈泡狀膨出。見圖1。

圖1 各組HSC-T6細胞培養72 h后透射電鏡下形態(×3 000)

2.3各組細胞中MMP-2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組MMP-2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平均明顯低于細胞對照組(P均<0.05),秋水仙堿組MMP-2水平明顯低于荔枝核總黃酮組(P<0.05),荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組HSC-T6細胞培養72h后細胞中MMP-2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平比較

2.4各組細胞中JNK、ERK、p38 mRNA表達情況荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組JNK、ERK、p38 mRNA相對表達量均明顯低于細胞對照組(P均<0.05),荔枝核總黃酮組與秋水仙堿組JNK、ERK、p38 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表5。

表5 各組HSC-T6細胞培養72 h后細胞中JNK、ERK、p38 mRNA相對表達量比較

2.5各組細胞中MAPK信號通路相關蛋白陽性表達情況 各組細胞質和細胞核內均有JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38蛋白表達。荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達平均光密度值均明顯低于細胞對照組(P均<0.05),荔枝核總黃酮組與秋水仙堿組p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達平均光密度值比較差異均無統計學意義(P均>0.05);3組間JNK、ERK、p38蛋白表達平均光密度值比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖2及表6。

表6 各組HSC-T6細胞培養72 h后細胞中MAPK相關蛋白陽性表達平均光密度值比較

3 討 論

MAPK信號傳導系統的重要分支信號通路,是啟動鄰近靜息態 HSC 激活和轉化的初始信號之一。MAPK通路是3種激酶的級聯反應,其中最上游激酶是MAPKKK,對細胞外和細胞內各種信號均有反應,并通過直接磷酸化激活中間激酶MAPKK,MAPKs對各種各樣的輸入信號做出反應,包括生理信號以及內源性應激和環境信號[13]。所以,它們傳統上被分類為有絲分裂原和應激激活的MAPKs,其中ERK為有絲分裂原應答的經典代表,而JNK和p38是應激激活的MAPKs[14]。肝纖維化是肝內實質及非實質細胞在各種致病因素的作用下被激活,從而促進基質降解,誘導細胞發生炎癥反應,進而導致肝纖維化的發生發展,抑制HSC活化與增殖或促進其凋亡則是阻止肝纖維化發生發展的重要策略。目前研究表明,MAPK信號通路作用與HSC的激活或者增殖有關[15]。徐杰等[16]研究發現,人參皂苷Rh2可通過抑制ERK1/2、JNK、p38、IκBα的磷酸化,明顯降低p-p65的表達而抑制肝纖維化的發展。由此可見,MAPK信號通路中的關鍵信號分子是肝纖維化治療的主要靶點之一,通過干預該通路的上下游關鍵應答因子阻斷信號傳導,可發揮預防或逆轉肝纖維化的效應。

本實驗結果表明,荔枝核總黃酮可顯著抑制HSC-T6細胞增殖,當其濃度達160 μg/mL且干預時間達72 h時,這種增殖抑制作用最為明顯,這表明荔枝核總黃酮抑制HSC增殖的效應具有劑量和時間相關性。電鏡觀察發現,荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組HSC-T6細胞核內染色質濃縮,部分染色質邊聚,核膜皺縮,也說明荔枝核總黃酮及秋水仙堿均可以抑制HSC-T6細胞增殖。ELISA檢測結果顯示,荔枝核總黃酮組和秋水仙堿組MMP-2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平均較細胞對照組明顯降低,說明荔枝核總黃酮、秋水仙堿可以抑制膠原沉積,減輕肝纖維化。RT-PCR及免疫組化結果顯示,荔枝核總黃酮可能通過下調JNK、ERK、p38 mRNA表達及抑制p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白磷酸化的方式參與調控MAPK信號通路,從而發揮抑制肝纖維化的作用。

綜上所述,荔枝核總黃酮具有抗肝纖維化的生物學效應,其作用機制可能與調控MAPK信號通路相關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。