山仙顆粒對Hepa1-6肝癌細胞遷移與侵襲及Wnt/β-catenin信號通路的影響

潘艷芳,毛偉嬌,謝 敏,屈夢揚,方 艷,應小平

(陜西中醫藥大學基礎醫學院,陜西 咸陽 712046)

肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤,其中肝細胞癌(HCC)約占90%。目前,癌細胞的轉移和復發仍然是影響預后的關鍵因素[1-2],即使進行根治性切除,仍有60%～70%的HCC患者在5年內出現轉移和復發,而局部治療的轉移復發率更高[3],故如何抑制肝癌細胞的侵襲和轉移至關重要。研究表明,上皮-間充質轉化 (EMT) 在肝癌轉移中起著關鍵作用[4],調控或逆轉EMT過程對于抑制肝癌侵襲和轉移具有重要意義[5]。而Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細胞EMT過程中發揮關鍵作用[6],故推測調控該通路可能會影響EMT過程。山仙顆粒是由陜西中醫藥大學附屬醫院中西醫結合腫瘤內科團隊開發的一種中醫藥抗癌制劑,前期研究證實該藥可通過增強T細胞活性、促進基質金屬蛋白酶-9(Caspase-9)和Capase-3介導的腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞增殖及移植瘤生長[7-9];還可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化、下調其下游靶基因的表達而減輕大鼠肝癌前病變[10]。本研究旨在通過觀察山仙顆粒含藥血清對Hepa1-6肝癌細胞遷移、侵襲能力以及EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 、波形蛋白(Vimentin)和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響,驗證山仙顆粒是否通過調節Wnt/β-catenin信號通路來調控EMT進程,為臨床中山仙顆粒用于防治肝癌轉移提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物與細胞 清潔級雄性SD大鼠24只,5～6周齡,體重(180±10)g,購自成都達碩實驗動物有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(川)2020-030,飼養于陜西中醫藥大學科研實驗中心動物房。 飼養溫度(23.0±2.0)℃,濕度(50.0±10.0)% ,自由飲食飲水,12/24 h晝夜明暗交替。鼠源性肝癌Hepa1-6細胞株,購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2藥物及試劑 山仙顆粒主要由西洋參、鱉甲、龜板、莪術、生山楂、仙鶴草、丹參、薏苡仁、豬苓等組成,由陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑科制備(批號:20190409,規格:10 g/包),干膏得率約為25.2%,成品顆粒的臨界相對濕度為62%,休止角為29.89°。KYA1797K(Wnt/β-catenin信號通路抑制劑, 上海金畔生物科技有限公司,CAS 1956356-56-1)。DMEM高糖培養基(北京索萊寶科技有限公司,12100-500);基質膠(美國 BD Biosciences 公司,356234);結晶紫染色液(北京索萊寶科技有限公司,G1062);HRP-羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,BA1054);Anti-E-cadherin抗體(北京博奧森生物技術有限公司,bs-1519R);Anti-N-cadherin抗體(北京博奧森生物技術有限公司,bs-1172R);Anti-Vimentin抗體(北京博奧森生物技術有限公司,bs-0756R);anti-β -catenin抗體(英國Abcam 公司,ab6302);anti-磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)抗體(英國Abcam 公司,ab75745);DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司,SA2023);SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,SA1023)。

1.3實驗儀器 超凈工作臺(新加坡ESCO,型號:AC2-4S1);CO2培養箱(新加坡ESCO,型號:CCL-240A-8CCL-240B);倒置生物顯微鏡(日本尼康,型號:TS100-F);正置顯微鏡(Zeiss AxioImager A1配Nikon DXM1200F);全自動凝膠成像系統(美國ProteinSimple公司,型號:FC3)。

1.4含藥血清的制備 將24只SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為山仙顆粒低、中、高劑量組和空白組,每組6只。根據人體和動物的體表面積折算系數進行藥物劑量換算,山仙顆粒低、中、高劑量組分別給予1.56 g/(kg·d)、3.125 g/(kg·d)、6.25 g/(kg·d)的山仙顆粒灌胃,空白組給予等容積的PBS灌胃,均每天1次,連續灌胃1周。末次灌胃后12 h采集腹主動脈血,在4 ℃下3 000 r/min離心15 min,收集血清。將4組大鼠血清置于56℃水浴鍋中滅活30 min,經過無菌濾器除菌和分裝后,存放于-80 ℃冰箱備用。

1.5細胞培養及分組 Hepa1-6細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養。將細胞分為空白血清組、KYA1797K組及山仙顆粒低、中、高劑量含藥血清組,分別加入空白血清、KYA1797K和0.25 g/mL、0.5 g/mL、1 g/mL的山仙顆粒含藥血清培養。各組細胞在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養箱中培養48 h,通過倒置顯微鏡觀察細胞狀態,取處于對數生長期且狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.6檢測指標及方法

1.6.1Hepa1-6細胞遷移能力 采用劃痕實驗檢測:在6孔板的背面使用直尺和記號筆畫出橫向平行線,確保每個孔都有3條線穿過,每條直線之間的間隔約為0.5～1 cm。當每個孔中的細胞生長至約70%時,將培養基更換為含有2%胎牛血清的培養基,繼續培養至80%,并讓其過夜以完全鋪滿。使用200 μL槍頭,垂直在孔板內用記號筆標記細胞劃痕,動作要輕柔,盡量保持劃痕寬度一致。倒掉舊的培養液,并用無菌PBS清洗3次。然后分別加入相應分組的培養基,將孔板放置在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續孵育。在劃痕后的0 h、12 h、24 h和36 h,使用倒置生物顯微鏡定位觀察同一劃痕區域,并采集圖像。

1.6.2Hepa1-6細胞侵襲能力 采用Transwell細胞侵襲實驗檢測:在無菌環境下,使用不含血清的培養基稀釋基質膠,并取200 μL加入到Transwell的上室中,使其干燥后放置于6孔板中。取不同處理組培養12 h、24 h和36 h后的Hepa1-6肝癌細胞消化并計數,然后重懸細胞,調整細胞密度為1×105個,往Transwell的上室中加入200 μL細胞懸液。在Transwell的下室中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基600 μL,然后將其置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置孵育24h,使用4%多聚甲醛固定20 min,隨后進行結晶紫染色2～5 min。使用倒置生物顯微鏡觀察Transwell小室背面的細胞,在100倍光鏡下選擇上、下、左、右、中5個不同的視野,并采集圖像,被結晶紫染成紫紅色的細胞為穿過膜的肝癌細胞。

1.6.3Hepa1-6肝癌細胞中EMT相關蛋白及β-catenin、p-GSK3β蛋白表達情況 采用Western blot 法檢測:收集上述不同處理組培養12 h、24 h和36 h后的Hepa1-6肝癌細胞,提取蛋白,并使用BCA法測定蛋白濃度。將樣品在4 ℃下14 000 r/min離心5 min,取上清液。將蛋白樣品進行12% SDS-PAGE凝膠電泳,然后電轉至PVDF膜。在5%脫脂奶粉中封閉膜1 h,接著加入兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin、β-catenin和p-GSK3β,在4 ℃的搖床上過夜。第2天在室溫下孵育二抗1 h,然后使用TBST洗膜3次。滴加發光液后進行顯影成像,并使用伯樂化學發光成像系統進行曝光,采用Image J軟件計算圖像灰度值。

2 結 果

2.1各組Hepa1-6肝癌細胞遷移能力 隨著干預時間的延長,各組細胞劃痕間距逐漸減小;干預12 h后,山仙顆粒低劑量含藥血清組的細胞遷移距離與空白血清組比較差異無統計學意義(P>0.05),山仙顆粒中、高劑量含藥血清組及KYA1797K組的細胞遷移距離均明顯短于空白血清組(P均<0.05);干預24 h、36 h后,山仙顆粒各組及KYA1797K組的細胞遷移距離均明顯短于同期空白血清組(P均<0.05);山仙顆粒低、中、高劑量含藥血清組各時間點的細胞遷移距離呈劑量依賴性縮短,組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖1及表1。

表1 各組Hepa1-6肝癌細胞遷移距離比較

2.2各組Hepa1-6肝癌細胞侵襲能力 隨著山仙顆粒含藥血清劑量增加和干預時間延長,穿膜細胞數量逐漸減少;山仙顆粒各組及KYA1797K組干預12 h、24 h、36 h后的穿膜胞數量均明顯少于同期空白血清組(P均<0.05);山仙顆粒低、中、高劑量含藥血清組各時間點的穿膜細胞數量呈劑量依賴性減少,組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖2及表2。

注:紫紅色的細胞為穿膜肝癌細胞

表2 各組Hepa1-6肝癌細胞侵襲數量比較個)

2.3各組Hepa1-6肝癌細胞中EMT相關蛋白表達情況 與空白血清組比較,山仙顆粒各組及KYA1797K組干預12 h、24 h、36 h后細胞中E-cadherin蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05);山仙顆粒低、中、高劑量含藥血清組各時間點的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量呈劑量依賴性升高或降低,組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組Hepa1-6肝癌細胞培養12 h、24 h、36 h后細胞中E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin蛋白表達情況

2.4各組Hepa1-6肝癌細胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表達情況 山仙顆粒各組及KYA1797K組干預12 h、24 h、36 h后細胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白相對表達量均明顯低于同期空白血清組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 各組Hepa1-6肝癌細胞培養12 h、24 h、36 h后細胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表達情況

3 討 論

目前,肝癌的診療手段和治療措施不斷優化升級,然而肝癌的復發轉移依然是全球面臨的難題[11]。近年來中醫藥防治惡性腫瘤的研究表明,中醫藥在提高機體免疫功能、緩解癥狀、延長壽命和提高生活質量等方面具有獨特的優勢。中醫將肝癌歸屬于“臌脹”“肝積”“癥瘕”等范疇,關于肝癌的侵襲轉移病機有癌毒傳舍、痰毒流注、正虛毒結、風邪內動等理論。其中正虛毒結與肝癌的病因認識相符,即正氣不足,邪氣乘虛而入[12],扶正祛邪、先安未受邪之地等治法可有效抑制肝癌的侵襲轉移[13-15]。山仙顆粒是陜西中醫藥大學附屬醫院中西醫結合腫瘤內科團隊數十年臨床經驗和藥理研究的結晶,具有扶正培本、活血化瘀、消腫抗癌等功效,在治療肝癌、肺癌等惡性腫瘤中顯示出良好的效果。

肝癌的侵襲轉移是一個復雜的生物學過程,轉移通常發生在EMT之后,EMT被認為是誘發腫瘤浸潤和轉移的早期關鍵事件。在EMT過程中,腫瘤細胞除了改變其黏附能力外,遷移和侵襲能力也會增強[16-17]。本研究細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗顯示,山仙顆粒各組的細胞遷移距離、細胞穿膜數量隨著山仙顆粒劑量的增加而明顯減小或減少,表明山仙顆粒可以抑制Hepa1-6肝癌細胞的遷移和侵襲,從而抑制EMT過程。

目前研究認為E-cadherin的表達下調或缺失會促使腫瘤細胞發生EMT,從而增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力;而N-cadherin表達上調可使腫瘤更具侵襲性,更容易發生轉移[18]。Vimentin在EMT中的作用主要是改變細胞骨架和相關蛋白結構,導致細胞失去極性并減少與基底膜的連接,進而增強細胞的侵襲和遷移能力。本研究中山仙顆粒各組的E-cadherin蛋白相對表達量明顯高于空白血清組,N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量均明顯低于空白血清組,說明山仙顆粒對Hepa1-6肝癌細胞的EMT標志蛋白產生了有效的負向調節作用,并且這種調節效果也呈現劑量依賴性。

EMT的發生受到精密的調控機制影響。胞外信號與膜上特定受體結合后,將信號傳遞入細胞內,通過多個信號通路激活核內轉錄因子,最終實現對EMT相關基因表達的調節。在EMT過程中,Wnt/β-catenin信號傳導起著重要作用,主要是因為它調控與EMT相關的基因轉錄組[19]。在經典Wnt信號通路中,β-catenin是最重要的分子。當Wnt信號未被激活時,細胞內的β-catenin不會在細胞質中積累,它會被由Axin、APC、GSK3β、CK1α組成的破壞復合物降解[20],其中的GSK3β可以磷酸化β-catenin,并導致其降解。當Wnt蛋白與細胞膜上的Frizzled受體結合時,經典Wnt通路被激活,細胞內的蓬亂蛋白(Dsh)通過磷酸化而激活[21]。激活的Dsh與破壞復合物中的Axin直接相互作用,導致破壞復合物解離,這使得破壞復合物中的GSK3β無法繼續磷酸化β-catenin,從而避免了β-catenin的降解,導致β-catenin在胞漿中積累。當β-catenin在胞漿中達到一定水平時,它會進入細胞核,并與核內TCF/LEF家族的轉錄活化因子協同作用,激活靶基因的轉錄。在經典Wnt通路的調控下,一些下游靶基因如Snail1等與EMT相關的轉錄因子被激活。除了在Wnt通路調控中的重要性外,β-catenin還在細胞內起到連接細胞膜上E-cadherin和肌動蛋白骨架的作用,從而參與細胞間的黏附。激活Wnt通路導致β-catenin進入細胞核后,會一定程度上減弱其與E-cadherin之間的相互作用[22]。因此,Wnt通路激活會通過調控靶基因轉錄影響EMT,并通過抑制E-cadherin/β-catenin復合物進一步削弱細胞間的相互黏附,影響EMT進程。本研究發現,山仙顆粒含藥血清能夠下調Hepa1-6肝癌細胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表達。

綜上所述,Hepa1-6肝癌細胞的遷移和侵襲能力與E-cadherin表達呈負相關,而與N-cadherin、Vimentin表達呈正相關。山仙顆粒含藥血清可能通過調節Wnt/β-catenin信號通路,上調Hepa1-6肝癌細胞中E-cadherin的表達,下調N-cadherin和Vimentin的表達,從而減弱Hepa1-6肝癌細胞的遷移和侵襲能力。這一細胞分子水平的證據揭示了山仙顆粒抑制肝癌細胞遷移和侵襲的作用機制,可能涉及抑制Wnt/β-catenin信號通路介導的EMT過程,這為山仙顆粒在臨床防治肝癌轉移方面的應用提供了實驗基礎。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。