清化飲對脾胃濕熱證抑郁大鼠血清5-HT與海馬組織的影響

黎嘉雯,王謹敏,陳銘楊,季葉薇,陳華琴,蘇小琴,鄭登滋

(福建中醫藥大學附屬第二人民醫院,福建 福州 350003)

抑郁癥是不可忽視的公共健康隱患,其全球患病率達27.6%[1]。抑郁癥發病機制復雜,目前研究認為有關的機制有單胺類遞質假說、腦腸軸異常、炎癥免疫系統異常等[2]。神經遞質的失衡, 尤其是5-羥色胺(5-HT)減少是抑郁癥的病理生理學基礎,許多新的治療策略都是基于提高5- HT水平來對抗抑郁癥[3]。而腦-腸軸失調會產生條件致病菌或有害菌,導致腸道屏障通透性增加,進一步激活機體免疫系統,釋放細胞及炎癥因子[4],在免疫失衡的炎癥條件下,血腦屏障完整性受到影響,炎癥因子更容易進入大腦,產生神經炎癥,導致抑郁樣行為產生[5];另外抑郁患者的腸道微生物組成發生變化,即腸道促炎細菌富集和抗炎細菌減少,這與其他系統性和腸道炎癥相關的疾病類似,進一步印證了抑郁癥的炎癥假說[6]。除了神經遞質和神經內分泌紊亂外,抑郁也導致中樞神經系統結構改變,包括海馬區神經元細胞數量減少、神經元可塑性過程減弱等[7-8]。目前該病主要采用抗抑郁藥物治療,但起效可能需要長達4周的時間,且可引起胃腸道癥狀、體重增加、泌汗等不良反應[9],這些不良反應常先于療效出現,造成患者的用藥依從性不佳,從而過早停藥影響病情。相比之下,中醫整體論治理念防治抑郁癥有明顯優勢,中草藥中含有的多種活性化學成分可多靶點、多途徑綜合發揮抗抑郁作用,可避免因使用單一成分而引起的不良反應[10]。清化飲系國醫大師楊春波先生治療脾胃濕熱證之專方,本研究團隊前期實驗證實清化飲能夠改善濕熱證大鼠的焦慮行為與腸道炎癥[11]。本實驗基于腦腸互動理論,探討了清化飲對抑郁模型大鼠海馬組織及血清5-HT含量的影響,以進一步明確其抗抑郁機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級SD雄性大鼠30只,體重(200±20)g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物使用許可證編號:SCXK(京)2019-0008。大鼠飼養于福建中醫藥大學附屬第二人民醫院實驗動物中心,飼養環境室溫(20±2)℃,實驗期間大鼠自由飲食和飲水,適應性喂養7 d。本實驗得到福建中醫藥大學附屬第二人民醫院實驗動物倫理委員會批準(倫理審批號:FJPSPH-IAEC2022054)。

1.2藥物 清化飲由福建中醫藥大學附屬第二人民醫院制劑室生產和提供(閩藥制字Z05104030),組方:黃連33 g、佩蘭66 g、茵陳110 g、薏苡仁220 g、赤芍110 g、茯苓220 g、厚樸66 g、白豆蔻33 g、白扁豆220 g,合并煎液濾過,分裝滅菌成250 mL/瓶,生藥濃度為2.2 g/mL。鹽酸舍曲林片(唯他停):浙江京新藥業股份有限公司生產,國藥準字H20051076。

1.3儀器與試劑 脫水機(湖北孝感闊海醫療科技有限公司,型號:KH-TS),包埋機(湖北孝感闊海醫療科技有限公司,型號:KH-BL),切片機(LEICA,型號:RM-2235),凍臺(湖北孝感闊海醫療科技有限公司,型號:KH-BL),烤箱(精宏,型號:XMTD-8222),載玻片(世泰,型號:10128105P-G),正置光學顯微鏡(OLYMPUS,型號:CX23),成像系統(MSHOT,型號:MSX2),病理切片掃描影像系統(InteMedic,型號:IMD-Neo-5X),酶標分析儀(TECAN,型號:HydroFlex),洗板機(TECAN,型號:HydroFlex),離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司,型號:KDC-1044L),振蕩器(江蘇康健醫療用品有限公司,型號:KJ-201A),水浴鍋(常州國華,型號:HH-60),移液器(仟佰度計量檢測有限公司); 無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:100092683),二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10023418),蘇木素(Solarbio,貨號:G1140),伊紅(Solarbio,貨號:G1100),中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10004160),5-HT酶聯免疫吸附測定試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司,產品編號:YX-050820R)。

1.4實驗方法 隨機取5只大鼠作為空白組,予以正常飲食、飲水。其余25只大鼠飼以高脂高糖飲食和給予慢性不可預知溫和應激建立脾胃濕熱證抑郁模型,具體方法:10%糖水自由飲用,同時隔日交替予以肥甘飼料(由普通喂養飼料中混入12%豬油+8%蜂蜜而成)、白酒飼料(由普通飼料加入52度白酒經蒸餾水1∶1稀釋后均勻浸泡而成),在大鼠可耐受范圍內同時進行慢性不可預知溫和應激刺激,刺激因子包括禁食24 h、禁水24 h、傾斜籠子24 h、夾尾1 min、暖泳(水溫35 ℃)5 min、冰泳(水溫10 ℃)5 min、異物(塑料盒)24 h、束縛30 min,以上刺激隨機出現,每天1種,每種刺激不連續出現,保證隨機不可預知性,連續造模28 d。造模第28天根據大鼠強迫游泳實驗和癥狀表現判斷造模是否成功,脾胃濕熱證的主要表現為大鼠逐漸出現喜扎堆,毛發粗糙,大便溏、質黏、臭味重等。 將造模成功大鼠隨機分為模型組6只、清化飲組6只、舍曲林組6只、清化飲+舍曲林組7只,根據人與大鼠之間的用藥劑量換算,清化飲組給予清化飲27.5 g/kg灌胃,舍曲林組給予舍曲林片5.21 mg/kg灌胃,清化飲+舍曲林組給予清化飲27.5 g/kg和舍曲林片5.21 mg/kg灌胃(兩種藥物相隔1 h應用),模型組給予等體積的生理鹽水灌胃,均1次/d,連續灌胃28 d。灌胃期間清化飲+舍曲林組意外死亡1只。

1.5檢測指標及方法

1.5.1強迫游泳實驗 將大鼠置于直徑25 cm、高38 cm的圓柱形桶內,水深30 cm,水溫(23±2)℃,記錄大鼠5 min內的靜止時間,每只大鼠觀察結束后換水并將其擦干,再放下一只大鼠。

1.5.2體重 分別于灌胃前及灌胃28 d后稱量各組大鼠體重,計算各組大鼠體重變化量。

1.5.3血清5-HT水平 各組大鼠禁食不禁水24 h后進行麻醉,迅速打開腹腔經腹主動脈采集全血,于室溫靜置2h后,放入離心機予3 500 r/min 離心10 min,分離血清并分裝,置-80 ℃冰箱保存,使用酶聯免疫吸附法并嚴格按照試劑盒步驟測定血清5-HT水平。

1.5.4腦組織病理形態 處死大鼠,取其腦組織,以10%福爾馬林固定,常規石蠟包埋切片制備,每只大鼠海馬組織制作2張切片,光學顯微鏡(×200)下觀察海馬組織病理形態。

1.6統計學方法 采用 SPSS 23.0統計軟件進行數據分析,實驗數據不符合正態分布的計量資料用M(Q1,Q3)表示,多組間比較選用Kruskal-WallisH檢驗,進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠強迫游泳靜止時間比較 灌胃28 d后,空白組、模型組、清化飲組、舍曲林組、清化飲+舍曲林組大鼠的靜止時間分別為107.00(99.50,121.00)s、175.00(164.75,212.50)s、115.00(85.75,125.75)s、87.50(40.50,134.50)s、111.00(100.00,122.75)s,模型組大鼠的靜止時間明顯長于空白組(P<0.05),清化飲組、舍曲林組、清化飲+舍曲林組均明顯短于模型組(P均<0.05),各給藥組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.2各組大鼠體重比較 灌胃前,各組大鼠體重比較差異無統計學意義(P>0.05);灌胃28 d后,各組大鼠體重比較雖差異無統計學意義(P>0.05),但可見清化飲組體重最輕;清化飲組大鼠體重變化量明顯低于舍曲林組(P<0.05);清化飲+舍曲林組大鼠體重變化量與清化飲組、舍曲林組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白組和脾胃濕熱證抑郁各組大鼠灌胃前后體重比較[M(Q1,Q3),g]

2.3各組大鼠血清5-HT水平比較 灌胃28 d后,空白組、模型組、清化飲組、舍曲林組、清化飲+舍曲林組大鼠血清5-HT水平分別為339.26(296.22,355.17)ng/mL、289.55(250.63,304.53)ng/mL、311.42(279.40,318.17)ng/mL、507.41(495.63,552.84)ng/mL、577.72(456.55,612.21)ng/mL,模型組與空白組、清化飲組比較差異均無統計學意義(P均>0.05),舍曲林組和清化飲+舍曲林組均明顯高于模型組(P均<0.05),清化飲+舍曲林組明顯高于清化飲組(P<0.05),清化飲組與舍曲林組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組大鼠海馬組織HE染色病理形態 空白組海馬組織CA1～CA3區神經元細胞呈緊密有序排列,細胞形態未見異常,核仁明顯,胞質清晰,溝回帶厚度正常;模型組海馬體積減小,CA2～CA3區神經元細胞排列欠緊密,數目減少,溝回帶厚度變薄;各藥物組海馬組織CA1～CA3區神經元細胞緊密排列,細胞形態未見異常,溝回帶厚度較模型組厚,厚度接近空白組,其中清化飲組、清化飲+舍曲林組海馬組織CA1～CA3區神經元細胞緊密均勻排列優于舍曲林組。見圖1。

圖1 空白組和脾胃濕熱證抑郁 各組大鼠海馬組織病理形態(HE染色,×200)

3 討 論

腦-腸軸是中樞神經、腸神經、腸道菌群等組成的雙向信號調節系統,通過傳遞神經遞質或調節神經內分泌免疫等發揮作用[12]。慢性壓力不僅會影響大腦的正常生理功能,還會影響腸道菌群[13]。而腸道微生物群紊亂會損害腸道屏障的通透性[14],通透性變化激活會加劇與抑郁癥發病機制相關的全身炎癥反應,介導血腦屏障破壞以及一系列級聯反應的發生,激活的炎癥細胞因子在腸道和大腦之間進行相互傳遞,通過腸-腦軸影響大腦神經結構及情緒行為,最終誘發抑郁樣行為[15]。

濕熱證為濕熱合邪所致,濕熱之邪,性質纏綿,膠著不分,易滯氣機,上擾心神,下襲胃腸,且從現代醫學角度分析其與機體免疫功能失常、炎性和氧化應激反應有關[16],故認為濕熱證與抑郁癥的發病相關。清化飲為治療消化系疾病濕熱證的復方,方中黃連尤善清濕熱郁滯導致的中焦氣機不暢,佩蘭主入脾、胃二經而力專醒脾化濕,二藥合用可清熱消濁,共為君藥;茵陳、薏苡仁同歸脾、胃經,茵陳主清利濕毒,薏苡仁主瀉脾濕,共為臣藥,使熱得除、濕得解;佐以赤芍苦寒清瀉肝火,茯苓安神寧心兼以健脾,厚樸燥濕消滯以和脾胃,豆蔻行氣化濕以宣暢中焦;白扁豆性味甘微溫,可增健脾和中之力,以防苦寒清熱太過而損中焦。諸藥相配以清熱化濕,醒脾瀉肝,升清降濁,濕熱之邪分消而散,恢復中州氣機,使五臟驅平,脾胃正常運化,肝之疏泄無過猶不及,保持通暢條達。動物實驗發現,清化飲具有減輕炎性反應,修復胃腸黏膜屏障,調節腸道菌群的多樣性的作用[11,17]。

強迫游泳實驗是常用的檢測動物行為實驗,可用來評估動物的“抑郁樣”行為和藥物的抗抑郁作用[18]。本實驗結果顯示,清化飲組、舍曲林組、清化飲+舍曲林組大鼠的強迫游泳靜止時間均明顯短于模型組,表明清化飲、舍曲林單用及聯合應用對脾胃濕熱證大鼠抑郁行為表現均有改善作用。

舍曲林為選擇性血清素再攝取抑制劑(SSRIs)類藥物,是臨床抗抑郁一線用藥,比其他抗抑郁藥具有更好耐受性,但也會產生一些藥物不良反應,如體重增加、惡心、口干、腹痛腹瀉、消化不良等,且此類不良事件尤其是體重增加可能在停藥后持續存在,會降低患者的服藥依從性[9,19-20]。本實驗結果顯示,各組大鼠體重比較差異無統計學意義,但清化飲組的大鼠體重最輕,且該組大鼠的體重變化量明顯低于舍曲林組。提示清化飲相對舍曲林對體重的影響更小。

5-HT作為重要的單胺類神經遞質,超過90%的5-HT位于胃腸道中,主要由腸嗜鉻細胞產生[21]。5-HT作用廣泛,對情緒、睡眠、食欲等均有影響。Erritzoe等[22]發現抑郁癥患者5-HT釋放能力較正常人群差,為抑郁癥中5-HT功能障礙提供了明確的證據。動物實驗也證實抑郁大鼠血清中5-HT含量降低[23]。本研究中,模型組大鼠血清5-HT水平雖然與空白組比較差異無統計學意義,但也低于空白組,也說明抑郁大鼠存在血清5-HT水平降低;清化飲+舍曲林組大鼠血清5-HT水平明顯高于模型組和清化飲組,提示聯合療法調節5-HT分泌的作用可能優于單一療法。

海馬體是極易受到壓力影響的大腦結構之一,神經影像學研究發現抑郁癥患者的海馬體積較小[24]。慢性應激誘導的抑郁動物模型也可見海馬萎縮,神經元細胞減少,經抗抑郁藥物治療可促進神經元細胞再生[25-26]。海馬區是主要調控情緒反應與學習記憶的重要腦區,其中海馬CA2區在社交記憶形成方面發揮著核心作用,是將社交信息編碼成陳述性記憶所必需回路的關鍵組成部分[27]。精神性疾病中的社交記憶障礙亦與CA2神經元缺失有關[28]。CA3區含有大量神經元細胞,其神經元結構發生變化會引起情緒與認知的改變。本實驗研究發現模型組大鼠海馬體積減小,CA2～CA3的神經元細胞排列欠緊密,數目減少,溝回帶變薄,證明出現了形態結構上的病理改變;各藥物組大鼠海馬體積有所恢復,神經元細胞排列緊密,數目增加,溝回帶增厚。表明清化飲、舍曲林可改善脾胃濕熱證抑郁大鼠海馬組織病理形態。

綜上所述,清化飲可改善脾胃濕熱證抑郁大鼠的抑郁樣行為,其可能是經腦-腸軸上調血清中5-HT水平從而保護海馬組織神經元細胞而發揮抗抑郁作用,這為中醫藥基于腦腸軸治療抑郁癥提供了一定實驗依據。但清化飲是否可以通過其他機制來改善脾胃濕熱證大鼠的抑郁行為?與西藥聯合應用是否更有益?還需要進一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。