基于網絡藥理學的“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的作用機制研究

許孟月,姚文匯, 左永杰,劉紅霞,康曉靜

(1. 新疆醫科大學第四臨床醫學院,新疆 烏魯木齊 830000;2. 新疆醫科大學附屬中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830000;3. 新疆維吾爾自治區人民醫院,新疆 烏魯木齊 830000)

銀屑病是以界限清楚、大小不等的紅斑鱗屑為特征的慢性、炎癥性皮膚病。銀屑病可累及患者甲、黏膜和關節,甚至出現內臟損害,嚴重危害患者的身心健康,我國近年的患病率為0.5%～0.72%[1],并呈逐年上升的趨勢。銀屑病又稱“白疕”“干癬”“松皮癬”等,中醫認為銀屑病發病外因為六淫邪氣郁結肌膚,內因為血分熱燥肌膚失養合而致病,近現代醫家則多從血分論治[2]。劉紅霞教授發現新疆地區尋常型銀屑病患者多以斑塊型為主,病情頑固,反復發作。新疆氣候干燥,燥易傷津氣,飲食以肉食為主,易傷脾胃、生濕熱,形成“外燥內濕”的體質特征[3]。“土茯苓-綿萆薢”是劉紅霞教授基于新疆地區銀屑病患者體質特點提出的特色藥對,也是經驗有效方“健脾解毒湯”中的君藥,土茯苓解毒除濕、健脾胃,綿萆薢利濕去濁、解瘡毒,二者相合,達健脾祛濕解毒之功。研究表明,土茯苓、綿萆薢及其有效成分具有抗炎、抑制角質形成細胞增殖的作用[4]。查閱文獻發現土茯苓、綿萆薢治療銀屑病作用的研究多關注于單靶點和單個信號通路[5-6],而網絡藥理學可以將高通量的組學信息構建為中藥復方化學成分與生物系統相互作用網絡[7],將相關藥物的蛋白靶點納入一個龐大的生物學網絡中,尋找藥物起治療作用的潛在作用通路[8],與中藥“整體觀”理論不謀而合。因此,本研究采用網絡藥理學的方法,篩選獲得“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的關鍵靶點,探討“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的協同網絡機制,以期為其作用機制的深入研究提供基礎與思路。

1 材料與方法

1.1“土茯苓、綿萆薢”藥對化合物及靶點的篩選通過TCMSP(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫收集土茯苓、綿萆薢的化學成分,并以“OB≥30%、DL≥0.18”為篩選依據,初步篩選土茯苓、綿萆薢的活性化學成分及對應的潛在靶點信息,并根據王顯菲等[9]的研究成果補充綿萆薢相關化合物。綿萆薢相關化合物利用Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫下載化合物分子的CanonicalSMILES序列導入SwissADME平臺進行口服生物利用度及類藥性分析,將符合條件的活性成分導入SwissTargetPrediction數據庫進行蛋白靶標預測補充,條件為“Probability>0.3”,并采用Uniprot數據庫將蛋白質靶點標準化。

1.2“土茯苓-綿萆薢”藥對活性成分-靶點網絡的構建 使用Gene-cards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)數據庫,以“銀屑病”為檢索詞、以高度相關性為標準,篩選與銀屑病有高度相關性的靶點。將檢索得到的銀屑病靶點與土茯苓、綿萆薢藥對候選靶點在Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中生成韋恩圖,映射篩選出共同靶點。將共同靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件中構建“土茯苓-綿萆薢”藥對活性成分-靶點網絡。

1.3“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的核心靶點篩選 將交集靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)獲得“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的潛在作用靶點的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡。將獲得數據導入Cytoscape 3.9.1軟件,篩選Degree、BC和CC均大于等于中位數的節點為核心節點,所對應的靶點即為“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的核心靶點。

1.4核心靶點PPI網絡構建及Hub靶點分析 利用“1.3”項下核心靶點的PPI網絡,將網絡數據導入到Cytoscape 3.9.1軟件,利用基于CytoHubba插件對網絡中的節點進行計算,獲得Centrality and six centralities(MCC)、Maximum neighborhood component(MNC)、Stress 、Botteleneck、EcCentricity、Degree、Density of Maximum Neighborhood Component(DMNC)、Closeness、Radiality、Betweenness算法下排名前10位的共有節點,其所對應的靶點即為核心靶點PPI網絡中的Hub靶點。

1.5GO功能富集與KEGG通路富集分析 借助David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)將核心靶點的Gene symbol轉換成Gene ID;利用OmicShare Tools網站(http://www.omicshare.com/tools)對進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,取富集數量排名前25位的生物學過程及20條通路進行繪圖,并結合國內外文獻篩選與銀屑病相關的通路進行分析。

1.6“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病“活性成分-核心靶點-通路”網絡的構建 應用Cytoscape 3.9.1軟件將“土茯苓-綿萆薢”藥對、核心靶點及KEGG通路富集結果關聯,構建“活性成分-核心靶點-通路”網絡,分析相關拓撲參數,明確“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的重要活性成分、重要靶點及通路,進一步闡述“土茯苓-綿萆薢”治療銀屑病的作用機制。

1.7分子對接 選擇重要活性成分與重要靶點進行分子對接。在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的PDB格式,選擇原則如下:人源蛋白、分辨率高(≤2.5?)、具有原始配體以及結晶pH值應盡量接近人體正常生理范圍。同時,從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載小分子結構,后利用chendraw繪制小分子3D結構式,最后利用AutoDock vina處理蛋白受體和小分子配體進行對接,其結果用PyMOL對模型進行可視化。

2 結 果

2.1“土茯苓、綿萆薢”藥對化合物及靶點的篩選結果 通過TCMSP數據庫篩選得到有效化學成分17個,其中土茯苓15個、綿萆薢2個,文獻補充獲得綿萆薢8個,靶點共356個,其中土茯苓300個、綿萆薢56個,著重選取對藥物-疾病共同靶點有作用且口服生物利用度和類藥性較高的部分活性成分進行了展示,見表1,并通過Uniprot蛋白質數據庫標準化處理活性成分相應的作用靶點,將其轉化為基因名。

表1 “土茯苓-綿萆薢”藥對活性成分的基本信息

2.2“土茯苓、綿萆薢”藥對活性成分-靶點網絡“土茯苓-綿萆薢”藥對的25個活性成分預測得到作用靶點共212個,導入Cytoscape 3.9.1軟件構建“土茯苓-綿萆薢”藥對活性成分-靶點網絡,網絡包含239個節點和366條邊。網絡圖中藍色圓形節點代表藥對靶點,外圈代表藥物活性成分,邊代表成分與作用靶點之間的聯系,見圖1,圖中體現了“土茯苓-綿萆薢”藥對多成分、多靶點的協同作用特點。經分析后,得到度值排名前三的活性成分為槲皮素(quercetin)、薯蕷皂苷(diosgenin)、柚皮素(naringenin),度值排名前三的靶點為前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、90 kDa熱休克蛋白αB1(HSP90aB1)。上述活性成分在土茯苓、綿萆薢藥對發揮藥效作用的關鍵活性成分和關鍵靶點。

2.3“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的核心靶點篩選 通過檢索GeneCards數據庫,獲取銀屑病相關靶點共2 563個,經過Relevance score≥0.49為條件篩選后得到相關靶點1 900個,檢索OMIM數據庫獲得62個靶點,兩個數據庫合并去重后共獲得靶點1 926個。由“土茯苓-綿萆薢”藥對的25個活性成分預測得到作用靶點共213個,將靶點與1 926個銀屑病相關靶點映射取交集,得到111個“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的潛在作用靶點,見圖2。通過STRING數據庫將111個交集靶點進行PPI網絡構建。交集靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件后,該網絡由1 662條邊、97個節點構成,以中位數(Degree≥33)為篩選條件,得出重要節點。重要節點的PPI網絡包含39個節點和662條邊,其Degree、BC、CC的中位數分別為42.5,0.003 2,0.819 7,選取Degree、BC和CC均大于等于中位數的26個節點為核心節點,核心節點所對應的靶點即為“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的核心靶點,見表2。核心靶點篩選的具體流程,見圖3。結果提示,上述核心靶點在“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病中可能具有重要意義。

圖2 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病潛在作用靶點韋恩圖

圖3 “土茯苓-綿萆薢” 藥對治療銀屑病核心靶點篩選流程圖

表2 “土茯苓-綿萆薢” 藥對治療銀屑病的核心靶點信息

2.4核心靶點PPI網絡分析及Hub靶點篩選 將核心靶點PPI網絡數據導入Cytoscape 3.9.1軟件,運用CytoHubba篩選獲得網絡中MCC、Degree、DMNC、MNC、Stress、Botteleneck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness均排名前十的靶點,即為Hub靶點,包括PTGS2、MMP9、IL6、IL1β、CASP3、VEGFA、TP53和TNF,提示這些靶點可能是“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的關鍵靶點。

2.5“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的GO功能及KEGG通路富集分析 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病潛在作用靶點的GO功能富集結果見圖4。共富集到5 403個生物學過程(BP)條目,涉及含氧化合物反應、細胞化學刺激反應、脂質反應、傷口愈合等;細胞組分(CC)共富集到418個條目,涉及細胞間隙、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔等;分子功能(MF)共富集到739個條目,涉及受體配體結合、酶結合、細胞因子活性等,見圖5。KEGG富集分析得到182條信號通路,見圖6,涉及腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-17(IL-17)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、輔助性T細胞17(Th17)等與炎癥、細胞增殖等相關的信號通路。

圖4 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的PPI網絡及Hub靶點網絡圖

圖5 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病GO分析結果

圖6 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病KEGG分析結果

2.6“活性成分-核心靶點-通路”網絡分析 基于核心靶點所富集的與銀屑病相關的信號通路,構建“活性成分-核心靶點-通路”網絡,見圖7。“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的核心靶點分布及不同信號通路,進一步體現了“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病多成分、多靶點、多通路的特點。

圖7 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖

2.7有效成分及核心靶點的分子對接 選擇“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病“活性成分-核心靶點-通路”網絡中的重要節點,即重要活性成分薯蕷皂苷(diosgenin)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)和重要靶點AKT1、MAPK3、PTGS2、TNF、IL-6,使用AutoDock軟件進行半柔性分子對接。用結合能來判斷配體與受體結合的穩定性,兩者結合能越低說明結合得越穩定。由分子對接結果可知,小分子可以與靶點發生結合,其結合能均小于-5 kcal/mol,表明有效成分與靶點具有較強的結合力。對接結合力強的6組,見圖8,得出分子對接分析表,見表3。

圖8 “土茯苓-綿萆薢”藥對部分重要成分與重要靶點分子對接圖

表3 “土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病“核心成分-核心靶點”結合信息及參數Vina/(kcal/mol)

3 討 論

銀屑病是一種免疫介導的慢性、復發性、炎癥性、系統性疾病,其發病機制復雜,與遺傳、感染、內分泌等有關,涉及T細胞分化、炎癥細胞浸潤、角質形成細胞增殖等[10-11]。中醫治療銀屑病以“血分辨證”最為推崇,近代醫家進一步拓展“以血論治銀屑病”的思想,提出許多不同的致病原因。新疆地區特殊的氣候、人群飲食特點使尋常型銀屑病患者以氣虛質為多,劉紅霞教授提出“健脾祛濕”的學術觀點,自擬健脾解毒湯治療銀屑病臨床療效顯著。其中土茯苓、綿萆薢為健脾解毒湯的君藥,也是劉紅霞教授治療銀屑病的常用藥對,然其具體的分子機制尤其是“土茯苓-綿萆薢”藥對協同治療銀屑病的作用機制仍未見系統研究。

該研究通過拓撲分析得到“土茯苓-綿萆薢”藥對涉及的活性成分包括槲皮素(quercetin)、薯蕷皂苷(diosgenin)、柚皮素(naringenin)等。槲皮素是一種天然植物中含量豐富的膳食黃酮類化合物。一系列的研究表明,槲皮素具有抗炎、抗氧化、心臟保護、血管舒張、肝臟保護和抗癌等多種生物學特性[12]。槲皮素可抑制表皮增殖、抗炎,并可抑制NF-κB信號通路的激活,改善IMQ誘導的小鼠皮損,降低血清TNF-α、IL-6和IL-17水平,提高谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,減少皮膚組織丙二醛(MDA)的積累。薯蕷皂苷可抑制NF-κB通路,調節Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達誘導細胞凋亡,還可以通過抑制TLR4/Myd88下調促炎細胞因子,降低角質形成細胞中VEGF-α的表達而抑制血管的形成[13]。柚皮素是一種來自葡萄柚的類黃酮,具有多種藥理學作用,如自由基清除活性和抗氧化、抗凋亡和抗動脈粥樣硬化作用。柚皮素通過可保護角質形成細胞免受氧化應激損傷,抑制增殖并減少角質形成細胞中活性氧(ROS)的產生,抑制MAPK/p38的活化,降低IL-6、IL-1β[14]。

本研究通過構建潛在作用靶點的PPI網絡,獲得“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的Hub靶點,包括IL-6、TNF、VEGFA、MMP9、CASP3、TP53、IL-1β和PTGS2。IL-6和TNF參與銀屑病的發生發展,巨噬細胞和上皮細胞產生多種促炎遞質如IL-6、TNF等,誘導炎癥病變[15]。炎癥介質是基質金屬蛋白酶(MMP9)及其抑制劑TIMP1產生的關鍵調節劑,銀屑病患者血液循環細胞中MMP9的增加是該病呈現系統性病變的證據之一[16]。VEGFA是主要的促血管生成因子,在銀屑病患者皮膚中過表達,并與疾病嚴重程度相關[17]。CASP3是一種凋亡標記物,角質形成細胞凋亡在調控銀屑病表皮形態發生過程中起重要作用,CASP3的表達與銀屑病的病情呈正相關,Bears發現CASP3的表達與銀屑病的病情呈正相關,尤其是與位于四肢的早期銀屑病病變呈正相關[18],增加CASP3蛋白表達可能起到有效治療銀屑病的作用。TP53編碼的p53蛋白被稱為“基因組衛士”。在細胞周期中,p53不僅可以通過p21的表達修復G1期的細胞周期停滯,還可以通過Bcl-2/Bax通路介導細胞死亡。Moorchung[19]的研究發現p53是調節銀屑病表皮細胞的凋亡過程的一種重要的蛋白質。銀屑病皮損中,角質形成細胞是IL-1β的重要來源,IL-1β與銀屑病的皮損形成相關,并且隨著銀屑病皮損的加重而升高[20]。IL-1β與IL-23協同作用,促進Th17細胞產生IL-17及相關細胞因子。PTGS2又稱環氧化酶-2(COX-2),COX-2可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[21],同時COX-2還是HIF-1的下游基因,協同促進角質細胞增殖并出現表皮角化不全,棘層肥厚和真皮乳頭毛細血管增生[22],表現為銀屑病的組織病理變化。綜上,本研究所篩選的Hub靶點與銀屑病的發生發展密切相關,進一步說明了本研究結果的科學性。

KEGG通路分析結果表明“土茯苓-綿萆薢”藥對可能通過MAPK、TNF、IL-17、Th17等與炎癥、免疫、細胞增殖、分化相關的信號通路而發揮治療銀屑病的作用,充分體現了“土茯苓-綿萆薢”藥對多通路治療的作用特點。MAPK激酶構成了一組重要的3種信號通路,即p38、ERK1/2和JNK,參與細胞增殖、分化、基因表達和細胞凋亡等。在銀屑病皮損中,ERK1/2、p38MAPK和JNK的表達顯著增加,角質形成細胞生長因子能通過激活p38MAPK通路促進TNF-α、IL-1的表達,加重銀屑病炎癥損傷[23]。TNF具有較強的生物學活性,在銀屑病發病中起重要作用。TNF-α是一種促炎細胞因子,通過不同的途徑放大炎癥,誘導血管內皮細胞上的黏附分子促進炎性細胞進入皮損,刺激角質形成細胞產生其他促炎介質,最后活化真皮巨噬細胞和樹突細胞[24]。TNF-α抑制劑治療銀屑病的療效歸因于其對Th17細胞的抑制。Th17細胞被認為是銀屑病發病機制的核心。Th17亞群是一種獨特的促炎CD4+T細胞譜系,IL-1和TGF與IL-6結合后,可驅動初始CD4細胞向Th17細胞亞型分化產生IL-17A,Th17細胞還表達其他促炎細胞因子,包括IL-17F和IL-22,IL-22影響角質形成細胞分化,IL-22和IL-17誘導角質形成細胞中趨化因子的表達[25]。此外,TNF/IL23/IL17A軸廣泛參與機體的免疫應答,促進銀屑病炎癥反應的發生和表皮細胞的增殖[26],IL-17A和IL-22誘導角質形成細胞產生促炎細胞因子和抗微生物肽,促進銀屑病皮損中性粒細胞的募集和蓄積,進一步促進慢性炎癥[27]。IL-17和IL-22直接和間接作用于多種細胞,介導皮膚炎癥。因此,Th17通路是與銀屑病密切相關的信號通路。本研究發現,“土茯苓-綿萆薢”藥對相關活性成分與Th17信號通路中靶點IL-6和TNF具有較好的結合活性,表明Th17信號通路或為“土茯苓-綿萆薢”藥對治療銀屑病的關鍵信號通路,為后續研究提供了實驗方向及理論依據。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。