植物向重力反應中PIN-FORMED 介導的生長素極性運輸調控

王賢 彭亞坤 陳猛 孔夢娟 譚樹堂

（中國科學技術大學生命科學與醫學部生命科學學院前沿交叉科學與生物醫學研究所，合肥 230027）

植物在重力引導下的不對稱生長稱為植物的向重力性（gravitropism）。植物的向重力性是植物適應陸地環境的重要過程。植物向重力性反應（gravit?ropic response）的第一步是感受重力信號，根冠的柱細胞和莖的內皮層細胞中存在淀粉體，這些淀粉體被命名為平衡石，被認為是重力的感受器。根冠柱細胞和莖內皮層細胞通過淀粉體的沉降來感受重力變化［1-2］。近年來通過模式生物擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）的遺傳學和細胞生物學研究，基本上解析了植物向重力性反應過程中信號轉導的分子機理和細胞學基礎，大大增進了我們對于植物向重力性的認識。

長期以來，科學家們便認識到，植物激素生長素在植物的向重力性反應中發揮重要調控作用。細胞間生長素的定向運輸是生長素不對稱分布和細胞差異伸長的主要機制。在植物組織生長素的定向流動中，生長素輸出載體PIN?FORMED（PIN）的極性定位發揮重要作用［3-4］。模式生物擬南芥的基因組編碼了8 個PIN 蛋白，分別稱為PIN1-PIN8。在向重力反應過程中，根冠柱細胞中的PIN3、PIN7 等蛋白的極性定位發生改變，最終影響生長素在根尖的不對稱分布從而產生向地性彎曲。另外，在向重力反應中細胞骨架的排列發生改變，其影響PIN 蛋白在胞內的運輸和定位。近幾十年的研究表明，PIN蛋白在質膜上的極性定位決定生長素的運輸方向，是生長素在植物體內不對稱分布的決定因素。因此，本文從植物向重力反應、PIN 蛋白介導的生長素極性運輸、PIN 的內膜運輸和（重）定位及PIN 的蛋白翻譯后修飾等方面，探討植物向重力反應中PIN蛋白介導的生長素極性運輸調控。

1 植物的向重力性

1.1 植物的重力信號感知

重力是影響植物生長發育的重要環境因素。植物器官根據重力控制其生長方向，即向重力性。在這個過程中，植物的莖向上生長，表現為負向重力性，利于植物的出土、光合作用等；而根向下生長，表現為正向重力性，利于固著和吸收水分、營養等。重力響應包括幾個連續過程，即重力感應、重力信號傳導、細胞間信號傳輸和器官不對稱生長。

對重力刺激有響應的植物器官中，例如根冠和莖的內皮層，通常觀察到含有致密淀粉顆粒的質體，被稱為淀粉體（支鏈淀粉體）。植物器官偏離重力方向后，受到重力刺激，這些器官重定向，淀粉體沿著新的重力矢量沉積。目前被廣為接受的淀粉體-平衡石假說認為，植物通過體內一類富含淀粉體的特殊細胞即平衡石細胞來完成對重力的感知。在根冠柱細胞中，可觀察到隨重力方向沉降的淀粉體。在物理和遺傳上去除根冠可以令根部喪失重力響應，表明根冠負責重力感受或響應［5-6］。激光消融根冠中特定細胞實驗發現，第二層小柱細胞的內部細胞對根的向重力性貢獻最大［7］。在幾種地上部組織中，包括單子葉植物的胚芽鞘和胚軸，以及雙子葉植物的下胚軸和莖（花序）的維管束鞘觀察到沉降的淀粉體，表明這些組織是重力感知部位。在模式植物擬南芥中，有遺傳學證據表明，內皮層是地上部枝條重力感知組織。sgr1（shoot gravitropism1，也稱作scarecrow, scr）和sgr7（shoot gravitropism7，也稱作short?root, shr）突變體在根和地上部中都缺乏內皮層，導致地上部完全喪失向重力性，而它們的根仍然對重力刺激有反應［8］。

1.2 植物的重力傳感機制

在模式植物擬南芥中，淀粉在根冠柱細胞和內皮層細胞內質體中高度積累，稱為淀粉體，含有致密淀粉顆粒的支鏈淀粉體比周圍的細胞質重，導致在重力刺激時在平衡細胞中沉積到細胞底部［2］。缺乏淀粉合成能力的擬南芥磷酸葡萄糖變位酶（pgm）突變體在根和莖中表現出向重力性降低的表型［9-10］。淀粉過量突變體（sex1）在各組織器官中存在過量沉降淀粉體，下胚軸對重力響應更敏感［11］。

重力感應細胞感知淀粉體沉降的機制在最近取得的關于LZY 蛋白的突破性進展之前，并不完全清楚。曾有研究人員推測，質膜上可被拉伸等機械力信號激活的Ca2+通道作為重力傳感器，可能通過沉降的淀粉體與內質網相互作用，內質網膜局部變形激活鈣離子通，或可能通過重力傳感細胞內的肌動蛋白絲激活，鈣離子被釋放并充當重力信號轉導中的第二信使［12］。然而，機械性敏感離子通道與重力響應之間的關系尚未報道。重力刺激下，擬南芥根冠柱細胞Ca2+水平沒有任何變化［13］。胞質Ca2+變化是高度局部化的，所使用的技術無法檢測到。為了證明胞質Ca2+瞬時變化是由重力刺激誘導的，擬南芥幼苗中表達apoaegorin(鈣離子指示利)的擬南芥幼苗在重力刺激下促進胞質游離Ca2+濃度增加［14］，由于空間分辨率不足，并不清楚是否是根冠柱細胞胞質Ca2+水平變化。這些結果依賴于未來使用更加先進的技術得到證實，例如使用高靈敏度Ca2+傳感器的活細胞成像分析，以證明Ca2+的變化與重力信號傳導之間的聯系。

鑒于淀粉體將重力傳遞到膜和細胞骨架等細胞組分，重力反應對重力大小敏感。然而，結合離心超重力和傾斜儀來改變植物外界重力環境的生理實驗表明，幾種被子植物的莖向重力性不取決于重力的大小，而是取決于傾斜角度［15］。因而有學者提出了位置傳感假說，平衡石細胞類似于傾斜儀方式通過淀粉體在細胞內位置而不是重力大小感知傾斜［16］。活細胞直接觀察和仿生實驗發現，淀粉體以肌動蛋白依賴的方式動態移動，即使在輕微傾斜角度下也可以做出反應［17］。位置傳感器假說可能是一個有趣的概念，它將淀粉體沉積與向重力性的生化信號轉導聯系起來。

1.3 根中參與重力信號傳導基因

最新成果顯示，LAZY 家族蛋白在植物重力感知過程中發揮重要作用。植物感知到重力矢量的變化后，淀粉體沉降觸發信號轉導改變細胞中生長素運輸方向。一些基因已經證明參與重力信號轉導在根冠細胞中表達和發揮作用。

在近十幾年的研究中，LAZY 家族基因相關研究結果對于促進向重力信號轉導過程的理解至關重要。LAZY1 最初在水稻中發現，水稻lazy1 突變體莖（葉鞘和胚芽鞘）具有重力響應缺陷［18-19］。基于序列相似性比對，在擬南芥中發現6 個AtLAZY（也稱作NEGATIVE GRAVITROPIC RESPONSE OF ROOTS,NGR 或DEEPER ROOTING1, DRO1）家族成員和一個功能相反的基因［20-21］。本綜述中將這個基因家族統 稱 為LAZY1?LIKE（LZY）。LZY1、LZY2 和LZY3在擬南芥莖的向重力性中發揮冗余作用，而LZY2、LZY3 和LZY4 在根向重力性中發揮功能［22-23］。lzy1 lzy2 lzy3 三突變體植株的地上部沿地面生長，幾乎完全喪失了負向重力性。通過SCR（SCARECROW）啟動子特異性在莖內皮層細胞表達LZY 基因可以恢復三突變體莖的向重力缺陷，并且淀粉體沉降不受LZYs 影響［22］，說明LZYs 在淀粉體感受重力之后的過程中發揮作用。lzy1 lzy2 lzy3 重定向后，莖中上下側IAA5 轉錄水平沒有明顯差異，LZY 在重定向莖中生長素的不對稱分布起關鍵作用［22］。lzy1 lzy2 lzy3突變體重定向后根中未觀察到生長素熒光報告基因DR5rev::GFP 不對稱表達。lzy2 lzy3 lzy4 突變體重定向后，根中DR5rev::GFP 和DII::Venus 的表達表明，生長素在根上側的積累增加［21,23］。這些結果表明，LZY 蛋白在植物重力響應過程和生長素不對稱分布中起作用。

遺傳學證據表明，PIN3 在LZYs 下游起著重要的作用。LZY3 的CCL 結構域可以與RCC1?like domain（RLD）蛋白的BRX 結構域相互作用，根據淀粉體沉積后的重力方向，以極化方式將RLD 蛋白募集到側根的根冠柱細胞質膜上，形成LZY?RLD 復合體，從而引起PIN3 的重新定位以調節生長素的流動方向，導致側根的向重力性發生變化［24］。此外，還有一種含有BRX 結構域的蛋白BRX?LIKE4（BRXL4）能與LZY1 相互作用，通過將LZY1 從其發揮作用的質膜轉移到細胞核來負調控LZY1 的作用［25］。值得注意的是，當重力方向改變后，重定位的重力刺激會激活促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）介導的LZY 蛋白的磷酸化，從而增加其與淀粉體表面幾種質體外膜轉運（translocons at the outer envelope membrane of chloroplasts, TOC）蛋白的相互作用，促使LZY 蛋白由質膜向淀粉體轉運［26］。在淀粉體向新的重力方向沉積后，LZY 又會通過淀粉體轉移到質膜上，在新的重力方向下側形成極性定位，將淀粉體的位置信息傳遞給質膜，從而發出重力方向的信號［27］。這樣的一種細胞學機制很好地解釋了植物重力感知的淀粉體沉降是如何轉化為細胞的極化和生長素轉運方向的改變的，大大促進了我們對于植物向重力性的認識（圖1）。

圖1 根和地上部重力感應位置及相關調控基因Fig.1 Gravity-sensing positions and related regulators in roots and shoots

ARG1（ALTERED RESPONSE TO GRAVITY1）蛋白是根和下胚軸向性所必需的，其含有DnaJ 結構域和一個卷曲螺旋區，主要與膜互作相關，一部分區域與肌動蛋白細胞骨架相互作用［28-29］。ARG1及其同源基因ARG1?LIKE2（ARL2）突變減弱了重力刺激下根尖生長素的橫向再分布，但淀粉積累正常［30］。垂直生長的arg1 arl2 雙突變體的根冠柱細胞中，PIN3 的表達模式和亞細胞定位與野生型沒有明顯區別。然而，重力刺激下，PIN3 蛋白在arg1 arl2根冠柱細胞的重新定位受到影響［30］。因此，ARG1和ARL2 可能在重力信號傳導中起作用，影響PIN3的重定位和重力刺激后生長素的不對稱分布。

目 前， 數 個SGRs（SHOOT GRAVITROPISMs）已被證明參與不同植物器官的向重力反應。sgr1/scr（scarecrow）和sgr7/shr（short?root）突變體在地上部（包括下胚軸和莖中）沒有正常的內胚層，導致地上部向重力性缺陷［8］。sgr2、zig（zigzag）/sgr4和sgr8/grv2（gravitropism defective2）/kam2（kata?mari2）在下胚軸和莖內皮層中淀粉體不會向新的重力方向沉積，但根的向重力響應正常［31-33］。sgr3、sgr5 和sgr6 的莖而不是下胚軸或根的向重力反應缺陷［31,34-35］。SGR2 編碼液泡膜磷脂酶A1（phospholi?pase A1, PA?PLA1），SGR3 編碼的t?SNARE AtVAM3與ZIG/SGR4 編碼的v?SNARE AtVTI11 形成穩定的SNARE 復合物，介導的囊泡轉運到內皮層細胞中的液泡前體/液泡，突變體中液泡功能或形成的缺陷可能會干擾淀粉體的運動，導致無法感知重力變化［34,36-37］。SGR5 在功能上與其他SGR 成員不同，其主要在莖中重力感知的早期過程中起作用。研究發現高溫誘導SGR5 選擇性剪接，在莖的向重力作用減弱［38］。另外，SGR9 編碼定位于淀粉體上的RING 型E3 泛素連接酶［39］。SGR9 調節淀粉體和F?肌動蛋白之間的相互作用，并促進淀粉體與F?肌動蛋白的分離，使淀粉體沿重力方向沉積［39］。

這些發現為我們理解植物向重力性的分子機制提供了很好的基礎，但是ARG/ARLs、SGRs 是否或者如何參與LZYs 介導的重力感知過程，有待于未來深入的細胞學或生物化學探索。

2 PIN 蛋白介導的生長素極性運輸

生長素是最早被發現的一類植物激素，在調節植物發育和向性生長中具有重要作用。種子植物中，生長素主要通過極性運輸或維管系統進行運輸，極性運輸對建立和維持生長素濃度梯度至關重要，進而調節植物感知并響應發育和環境信號。在生長素極性運輸過程中，位于膜上的轉運蛋白發揮關鍵作用。PIN?FORMED（PIN）是定位在質膜上的生長素外排載體，通過極性定位調節細胞生長素的輸出方向。PIN 的極性定位決定了組織內生長素在細胞間的轉運方向，在胚胎發生、器官發生、組織分化和植物向性等多個生長發育過程中具有重要的調控作用［40］。

PIN 介導的生長素極性運輸在植物向重力反應過程具有重要功能。在向重力反應過程中，PIN 的極性分布會影響莖和根兩側生長素的不對稱分布，導致器官發生不對稱生長而彎曲。pin2 突變阻斷了重力誘導的生長素不對稱再分布并導致根出現向重力缺陷表型，表明PIN2 在根向重力反應中發揮重要作用，生長素通過中柱從地上部運輸到根尖進入皮層和表皮細胞，通過PIN2 向伸長區和分生區轉運［3,41］。重力刺激后生長素分布的時空調節與重力刺激根上下側細胞中的PIN2 豐度相關，根下側細胞中生長素分布增加伴隨著刺激后PIN2 豐度增加隨后逐漸減少；另一方面，根上側細胞中生長素分布減少伴隨著PIN2 豐度先減少隨后增加。根上下側細胞中質膜PIN2 蛋白水平對稱恢復可能促進重新建立對稱的生長素運輸，導致根垂直生長［41-42］。重力刺激后PIN2 在細胞內的重新定位取決于蛋白酶體活性［43］。有研究表明，在向重力過程中，植物激素赤霉素（gibberellin, GA）也發生不對稱分布，下側GA水平較高。GA 通過抑制PIN2 蛋白向液泡的降解來穩定PIN 蛋白，從而有助于穩定根下側PIN2，促進生長素不對稱運輸和分布［44］。此外，根下側生長素的增加促進了編碼分泌性小肽的GLVs（GOLVENs，也稱作ROOT GROWTH FACTOR LIKE）基因的表達。GLVs 基因在表皮和皮層細胞中的差異表達調節生長素運輸加劇PIN2 的極性分布［45］。另外，PIN3和PIN7 也參與根的向重力過程，這兩個蛋白均極性定位于根冠柱細胞的質膜上。重力刺激后，PIN3 和PIN7 極化到根冠柱細胞的下側，生長素運輸到根尖下側并驅動重力彎曲［46］。因此，重力刺激后根冠柱細胞PIN3 和PIN7 重新極化以及表皮細胞PIN2 不對稱分布促進生長素的再分布，抑制根上側生長素積累導致根向下彎曲。

擬南芥多個PIN 家族的成員參與到植物地上部的向重力反應中。pin3 突變導致下胚軸重力反應缺失，同源基因的突變體pin4 和pin7 以及pin4 pin7雙突變體在下胚軸向重力響應方面沒有表現出任何缺陷［47-48］。而pin3 pin7 雙突變體和pin3 pin4 pin7三突變體的表型強于pin3 單突變體［47-48］。這些遺傳證據表明，PIN3 是擬南芥下胚軸向重力過程中生長素差異運輸的主要參與者，而其他PIN 轉運蛋白發揮冗余作用［47］。重力刺激后下胚軸內皮層細胞中PIN3 極化到細胞下側的質膜，介導生長素向下胚軸下側運輸和積累促進生長和下胚軸彎曲［49］。

根的向重力性對于其三維構型（root system architecture, RSA）十分重要，主要表現為主根和側根以一定的角度進行生長。向重力性定點角（gravitropic setpoint angle, GSA）抑制根的正向重力生長促進根系徑向擴張。在細胞水平上，生長素極性運輸導致伸長區不對稱生長決定GSA 形成。在側根（lateral root, LR）形成早期階段，PIN3 在根冠柱細胞質膜上表達并不對稱分布，隨后在底部極化影響生長素不對稱分布促進GSA 形成［50］。側根形成后期，GSA 形成時，PIN3 整體表達水平降低，與生長素不對稱運輸減少以及側根以恒定GSA 非差異生長有關［50-51］。地上部枝條穩定在一定非垂直的角度生長依賴于生長素介導的負向重力性機制，通過調節重力感應細胞中PIN 的極化來控制側枝GSA［52］。擬南芥胞吐復合體亞基EXO70A3（EXOCYST70A3）通過調控PIN4 的亞細胞定位和生長素的極性轉運，在根GSA 和根系結構的調控中發揮重要功能，影響擬南芥不同生態型對不同生態環境的適應［53］。

3 PIN 的內膜運輸和（重）定位

PIN 的極性分布是通過質膜和內體區室（endosomal compartments）之間連續動態循環來維持的［54］。PIN 通過內吞作用分選到反式高爾基網（trans?Golgi network, TGN）和 早 期 內 體（early endosome, EE），進而通過囊泡運輸到質膜與膜融合或通過多囊泡體（muti?vesicular bodies, MVB）進入液泡降解［55-57］。

3.1 網格蛋白介導的PIN蛋白的內吞作用

PIN 蛋白通過網格蛋白介導的內吞作用（CME）從質膜（plasma membrane, PM）內化［56］。網格蛋白由重鏈（clathrin heavy chain, CHC）和輕鏈（clathrin light chain, CLC）組成［58］，包被著囊泡。chc 和clc突變體在PIN 運輸、極性定位中表現出缺陷，從而影響生長素分布和向性響應［55,59-60］。CHCs 是PIN蛋白被內吞和極性分布過程中所必需的［55-56］。而CLC2 和CLC3 影響CHC 與膜結合，以及生長素介導質膜蛋白內化和胞內運輸，clc2 clc3 雙突變體中生長素運輸和分布缺陷，導致生長素相關的多個發育過程出生缺陷［60］。PIP5K1 和PIP5K2 磷脂激酶共同調節的PI（4,5）P2在網格蛋白介導的質膜運輸、PIN 極化和生長素分布方面發揮重要作用。pip5k1 pip5k2 雙突變體影響生長素運輸并干擾PIN1、PIN2極化和內體循環［61］。生長素結合蛋白ABP1 通過將網格蛋白募集到PM 促進CME 并介導生長素對CME的抑制［60］。最近的結果表明，ABP1 互作蛋白TMKs和調控因子MAKR2 在PIN2 介導的植物向重力反應中具有重要調控作用［62-63］。植物激素生長素通過TMK 激活質膜上的質子泵，酸化細胞壁，促進細胞的伸長及組織生長［64-65］。

3.2 囊泡運輸調控PIN蛋白的（重）定位

在內吞和再循環過程中，PIN 蛋白分布于囊泡中，許多相關的調控蛋白均可以影響PIN 蛋白運輸。細胞骨架調控囊泡運輸，RAB 和ARF 小GTP酶將膜連接到細胞骨架，是細胞內運輸的主要調節因子［66］。ARF 蛋白以GDP 形式與囊泡膜較弱結合，以GTP 形式緊密結合。在ARF 與膜結合后，小G 蛋白ADP 核糖基化因子的鳥苷酸交換因子（ARF?GEF）被募集將ARF 小G 蛋白上的GDP 轉變為GTP。小分子化合物布雷菲德菌素A（Brefeldin A,BFA）通過與ARF?GDP/ARF?GEF 復合物結合來抑制ARF 蛋白的活化，可逆地抑制PIN1 從內體區室到質膜極性結構域的囊泡運輸［67-68］。對BFA 敏感的ARF?GEF GNOM 主要定位于高爾基體，部分定位于質膜和TGN/EE（trans?Golgi network/early endosome）。GNOM 調節PIN1 內體循環，進一步影響PIN1 的極性。BFA 對GNOM 的長時間（超過12 h）抑制導致PIN1 從根細胞的基部異常定位于細胞頂端，但遺傳改造的BFA 不敏感的GNOMM696L?myc 轉基因系僅導致PIN1 的再循環對BFA 不敏感［69］。BFA 處理或者GNOM 蛋白功能缺失都會抑制PIN1 質膜-內體之間的循環并破壞其基底極性分布，但對PIN2 的頂端極性定位影響不大，說明PIN 蛋白的頂端極性定位通過其他BFA 不敏感的ARF?GEF 介導［70］。GNL1（GNOM?LIKE1）是 一 種 類 似GNOM 的ARF?GEF，在內質網到高爾基體運輸中具有保守功能，在PIN2的內吞過程中具有選擇功能［69］。擬南芥磷酯翻轉酶ALA3 可 以 與GNOM 和BIG3（BIG/SEC7?RELATED PROTEIN3）等ARF?GEF 互作，調控PIN 的頂-基部極性定位，參與根的向重力性反應、子葉發育和葉維管束發育等多個過程中［71］。

在生物合成分泌和內吞作用后，PIN 蛋白一部分被回收到特定的質膜區域極性定位，一部分通過晚期內體（late endosomes, LE）或液泡前體（prevacuolar compartment, PVC）運輸到液泡膜降解。磷脂酰肌醇?3 激酶（PI?3K）是調節PIN 液泡降解所必需的，使用PI?3K 抑制劑渥曼青霉素（wortmannin, WM）處理導致LE 中PIN1 和PIN2 的積累［72-73］。液泡中以泛素化依賴的方式調節PIN 蛋白周轉也有助于質膜處PIN 蛋白極性［43］。PIN1 和PIN2 在snx1?1（sorting nexin1?1）和vps29?3（vacuolar protein sorting29?3）突變體中質膜上定位減少，AtSNX1 和VPS29 已被證明是獨立于GNOM 的不同內體區室介導PIN 蛋白從PVC免于降解進入再循環途徑［72-73］。AP?3（ADAPTOR PROTEIN3）和內體分選復合物（ESCRT）參與液泡PIN 蛋白的降解和分選［74-75］。

4 PIN 蛋白的可逆磷酸化修飾

PIN 介導的生長素轉運需要通過蛋白激酶調節PIN 的激活、極性分布和運輸。與PIN 磷酸化相關的激酶家族主要有AGC 激酶、受體激酶（RLK）、MAP 激酶和鈣調蛋白激酶（Ca2+/CALMODULIN?DEPENDENT PROTEIN KINASE?RELATED KINASEs,CRKs）。與蛋白激酶相反，某些磷酸酶也參與其中，包括蛋白磷酸酶2A（PP2A）、PP1 和PP6 等（圖2）。

圖2 翻譯后修飾調節PIN 蛋白定位Fig.2 Post-translational modifications regulate the localization of PIN

4.1 AGC激酶對于PIN蛋白的活性和極性定位起著重要的調控作用

擬南芥基因組編碼39 種AGC 激酶，其中23 種AGC 激 酶 形 成AGCVIII 亞 家 族［76］。在AG?CVIII 激酶中，有兩個亞家族直接參與PIN 介導的 生 長 素 轉 運：PID（PINOID）、WAG1（WAVY ROOT GROWTH1）和WAG2，以及D6PK 和D6PK?LIKE1-3。

PID/WAGs 磷酸化PIN 蛋白，既可以激活PIN轉運生長素的活性，也調控其蛋白的極性定位。pid突變體具有針狀花序，與pin1 突變體表型類似，這意味著PID 在生長素轉運或信號轉導中發揮作用［77-78］。PID 的過表達誘導根部內皮層和中柱PIN1、皮層PIN2 和表皮及皮層PIN4 從基部到頂部的異常極性定位，導致生長素濃度梯度喪失以及胚胎和幼苗根發育缺陷。pid 功能缺失突變體導致花序分生組織表皮層PIN 從基部向頂端極性的轉換抑制，無法建立頂端器官形成所需的局部生長素積累，阻止了新的側向器官的發生，從而形成針狀花序［79］。進一步遺傳和生化分析表明，WAG1 和WAG2 與PID 之間功能冗余，PID、WAG1 和WAG2 主要在表皮和側根冠細胞中表達，pid wag1 wag2 三突變體幼苗的根具有更明顯的向重力性缺失表型，干擾PIN 頂端定位影響生長素運輸，導致子葉發育、根系生長和根向重力缺陷［80］。PID/WAGs 磷酸化PIN蛋白的胞內結構域（PIN?HL）3 個高度保守TPRXS（N/S）基序的中間絲氨酸殘基S1?S3，調節PIN 極性定位［81-82］。PID、WAG 與PIN 蛋白相互作用并磷酸化招募MAB4/MEL（MACCHI?BOU4/MAB4（EN?P1）?LIKE）支架蛋白形成PIN/PID/MAB4 復合物形成正反饋調控，增加PIN 磷酸化并限制PIN 在其極性結構域的橫向擴散［83-84］。擬南芥WAV3（WAVY GROWTH 3）/WAVH 亞家族E3 泛素連接酶獨立于PID/WAG 蛋白激酶，在調控PIN 蛋白極性定位發揮重要作用［85］。此外，PID/WAGs 調節PIN3 蛋白在下胚軸向光性以及莖和根的向重力過程中的重新定位［86-87］。最近的研究表明，PP2A 可以去磷酸化PIN3 蛋白，與蛋白激酶PID/WAG 介導的磷酸化形成一種拮抗機制，參與到側根的角度維持和根系統的形態建成中［51］。

擬南芥D6PK 及其同源蛋白D6PKL1-D6PKL3主要調節PIN 轉運生長素的活性。D6PK 和D6PKL活性喪失導致典型生長素相關表型，如下胚軸向光性、負向重力性、避陰以及側根和芽分化，這些表型與極性生長素運輸受阻和分布異常相關［88-90］。與非極性定位的PID 不同，D6PK 在根表皮和中柱、下胚軸、莖和頂端分生組織細胞中，與細胞基底側極性分布的PIN 蛋白共定位［90-92］。與PID 類似，D6PK 也可以磷酸化PIN 蛋白絲氨酸S1?S3，此外，D6PK 還磷酸化S4 和S5，雖然這兩個位點在PIN3、PIN4 和PIN7 中保守，但PIN1 中不存在S5，PIN2缺乏S4 和S5。與PID 相反，D6PK 磷酸化PIN 不會改變PIN 蛋白極性，而是影響PIN 蛋白轉運生長素的能力。D6PK 和PID/WAGs 對PIN 的不同作用可能的原因是其對不同磷酸化位點的偏好［80,93］。

與D6PK 類似，與BRX 相關的蛋白激酶PAX（PROTEIN KINASE ASSOCIATED WITH BRX）對韌皮部發育至關重要［94］。PAX 與BRX 是PIN 蛋白激活的正向和負向調節因子，一起作為“分子變阻器”磷酸化并激活PIN 蛋白，動態調節生長素運輸和維管發育。在較低生長素水平下，質膜上PAX 招募BRX（BREVIS RADIX）并抑制PAX 活性，從而抑制PIN 的磷酸化，隨著細胞生長素水平升高，BRX降解或運輸到細胞核釋放PAX，PAX 被激活并刺激生長素運輸［95-96］。此外，該調節模塊另一個組成部分，生長素激活的磷脂酰肌醇?4?磷酸5?激酶（PIP5K），PIP5K 與BRX 相互作用，其靶向質膜有助于局部增強磷脂酰肌醇?4,5?二磷酸［PI（4,5）P2］的分布，共同形成一種自我增強調節模塊［96-97］。PDK1 也是AGC 激酶家族的成員，通常充當上游信號來磷酸化和激活D6PK 和PAX 以調節PIN 的極性，被認為是AGC 激酶活性的主要調節因子［97-99］。綜上所述，AGCIII 家族激酶在PIN 極性調節和生長素運輸方面可能具有獨立但部分重疊的作用。

4.2 參與調控PIN蛋白功能的其他蛋白激酶

除了AGC 激酶外，其他類型的蛋白激酶也參與調節PIN 的磷酸化。在擬南芥分枝的調控過程中，MKK?MAPK 信號級聯途徑起著重要的調控作用。MKK7?MPK6 磷酸化PIN1 的第337 位絲氨酸殘基（S337）位點，影響PIN1 的細胞內分布和極性定位，進而調節極性生長素的運輸［100］。PIN1?HL 中的T227、T248 和T286 位于S1?S3 屬于PID 磷酸化位點TPRXS（N/S）基序的一部分，被MPK4 和MPK6磷酸化［101］。MAPK 級聯信號傳導途徑是正常生長發育必需的，同時生物和非生物脅迫信號轉導方面也被發現起著廣泛的調控作用。因此，MAP 激酶調節生長素運輸可能是植物適應脅迫的重要組成部分。

擬南芥編碼的8 個鈣相關蛋白激酶（CRK）大多定位在質膜并在體外磷酸化PIN 蛋白。CRK5 在表皮和皮層細胞PM 呈現為“U”形定位，在crk5突變體中，其他蛋白極性定位不受影響，但PIN2 在表皮細胞頂側表達水平降低，皮層細胞從基底側到頂側定位轉換［102-103］。CRK5 激酶通過磷酸化PIN1、PIN2 和PIN3 調節蛋白活性介導根向重力反應、頂端鉤發育和調控胚胎發育過程［104-105］。

最近，質膜定位的受體樣激酶（receptor like kinase, RLK）成為另一類在質膜處磷酸化PIN 蛋白的激酶。受體激酶CAMEL（CANALIZATION?RELATED AUXIN?REGULATED MALECTIN?TYPE RLK）及其相互作用蛋白CANAR（CANALIZATION?RELATED RECEPTOR?LIKE KINASE）共 同 與PIN蛋白互作并磷酸化PIN。PIN1 中CAMEL 磷酸位點的突變影響其極性分布和運輸, 從而表現出葉脈和維管損傷后的再生缺陷［106］。

4.3 多種蛋白磷酸酶參與調控PIN蛋白的功能

可逆磷酸化修飾影響植物PIN 蛋白的極性定位，從而改變生長素運輸方向。與蛋白激酶相反，磷酸酶使PIN 蛋白去磷酸化。PP2A 磷酸酶是一種由支架亞基A、調控亞基B 和催化亞基C 組成的異源三聚體。PP2A 通過使PIN 蛋白去磷酸化來拮抗PID，二者共同決定PIN 蛋白的極性定位和轉運活性［107］。近期研究表明，PP2A 的C 亞基能夠與ABA受體PYR/PYLs 相結合，PP2A 的A 亞基直接與SA結合，以抑制PP2A 磷酸酶活性，從而調節PIN 蛋白的極性和根系發育［108-109］。有趣的是，PP2AA（PP2AA1?PP2AA3）、SAL（SAPS domain?like） 和FyPP1/3（PHYTOCHROME?ASSOCIATED SERINE/THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE1/3）之間相互作用形成PP6 異源三聚體全酶復合物。FyPP1/3、SAL 和PP2AA 與一部分PIN 蛋白相互作用，對于SAL，相互作用的強度取決于PIN 磷酸化狀態。因此，PP6 通過拮抗PID，直接調節PIN 蛋白磷酸化促進PIN 蛋白基部定位，進而影響生長素極性運輸和植物發育［110］。此外，PP1 家族一個成員，TOPP4（TYPE?ONE PROTEIN PHOSPHATASE4） 與PID 拮抗調節PIN1 蛋白磷酸化，調控生長素在表皮細胞內外的極性分布，控制鋪板細胞的形態建成［111］。

5 其他蛋白翻譯后修飾參與調控PIN 的功能

5.1 PIN的氧化還原修飾

S?亞硝基化（S?nitrosylation），是一種基于氧化還原的蛋白質翻譯后修飾，可通過改變蛋白的構象、穩定性、亞細胞定位、生物化學活性或蛋白質-蛋白質相互作用來調節蛋白的功能。細胞內蛋白S?亞硝基化的水平是動態的，由一氧化氮（NO）水平和S?亞硝基谷胱甘肽還原酶（GSNOR）和硫氧還蛋白（Trxs）催化的去亞硝基化調控［112-113］。GSNOR1 的缺乏通過一種未知機制抑制了PIN 的內吞作用。由于NO 也可以通過S?亞硝基化調節蛋白質功能，因此NO 可能直接通過S?亞硝基化PIN 或間接通過S?亞硝基化內吞途徑中的其他關鍵蛋白質調節PIN內化［114-115］。

5.2 PIN的寡聚（二聚化）

生長素轉運由PIN 蛋白的亞細胞極性定位決定，但對于PIN 蛋白復合物組成和調控方面的分子機制尚不清楚。生物化學實驗表明，PIN 核心復合體由PIN1、PIN2、PIN3、PIN4 和PIN7 的同源二聚體和異源二聚體組成（其中PIN1 同源二聚體最為普遍），生長素轉運抑制劑和調節劑，如內源黃酮醇和NPA（N?1?naphthylphthalamic acid），穩定PIN1 二聚體，影響極性生長素運輸，PIN1 胞質結構域的磷酸化可消除這種抑制作用［116-117］。最近的結構生物學證據表明，典型PIN1 和PIN3 蛋白以及非典型PIN8蛋白以對稱性的同源二聚體方式組裝，每個單體具有10 次跨膜螺旋，呈現出典型的NhaA 蛋白折疊方式，被分為支架（scaffold）結構域和轉運（transporter）結構域。區別于PIN8 二聚體向胞外開放狀態的構象，PIN1 呈現向細胞質側開放的構象，同時，在胞質側，還具有一個由β 折疊片組成的結構域［118-119］。PIN1的跨膜結構域共享一個保守的NhaA?fold。在底物與PIN1 的復合物結構中，IAA 通過疏水堆積和氫鍵進行配位，抑制劑NPA 與IAA 以更高的親和力競爭同一位點。PIN3 支架結構域中的跨膜螺旋1/2/7 參與二聚化，二聚化的PIN3 蛋白在二聚體界面形成一個面向胞外的腔，每個亞基都是面朝內的構象［120］。

PIN 處于內向開放狀態時，細胞內的IAA 結合在內向開放口袋中，引起PIN 二聚體由內向開放狀態向外向開放狀態轉換，IAA 被釋放至細胞外。生長素運輸抑制劑NPA 結合在底物結合位點，阻礙了IAA 的結合，同時抑制轉運過程中PIN 的潛在構象變化，并使蛋白處于朝內側開放的構象，抑制生長素極性運輸。

5.3 Pin1At調控PIN1蛋白的構象

PIN 蛋白胞內結構域TPRXS 基序內的脯氨酸殘基，可以發生順式/反式丙酰基異構化。Pin1 肽基脯氨酰順反異構酶（peptidylprolyl cis?trans isomerase,PPIase）是生物體信號轉導途徑的關鍵調節因子，特異性識別磷酸化的S/T?P 序列，催化其中的肽鍵發生順反異構，從而改變相關蛋白質特性，包括穩定性、亞細胞定位、磷酸化狀態、催化活性等［121］。擬南芥同源蛋白Pin1At 參與根的向重力性過程，Pin1At 過表達和pp2aa1 對增強根向重力缺陷表型具有協同作用，Pin1At 的下調抑制pp2aa1 和35S::PID的根向重力缺陷。Pin1At 催化PIN1 HL 中磷酸化Ser/Thr?Pro 基序的順式/反式構象變化，并影響PID和PP2As 介導的根冠柱細胞PM 中PIN1 的極性定位和生長素的轉運，這與根向重力性的調節相關［122］。

6 PIN 蛋白的抑制劑

特異性抑制劑在生長素運輸和PIN 蛋白轉運生長素分子機制的探究中發揮了關鍵作用。抑草生（NPA）是經典的生長素轉運抑制劑。研究發現，NPA 直接結合并抑制PIN 蛋白的轉運活性，使膜對生長素的滲透性降低，抑制生長素外排并阻斷生長素轉運介導的植物反應。內源性黃酮醇可以穩定PIN 二聚體以調節生長素外排，其方式與NPA 相同。另一種經典的抑制劑，2,3,5?三碘苯甲酸（TIBA），除了直接抑制PIN 介導的生長素運輸外，也可通過干擾PIN 囊泡運輸過程來破壞PIN 的膜定位。值得注意的是，有多種化合物被報道通過間接的途徑影響PIN 蛋白在內膜系統的分布，例如褪黑素、ES4、BFA 和渥曼青霉素等。表1 對PIN 蛋白相關抑制劑進行了總結。

表1 PINs 蛋白相關的抑制劑Table 1 Related inhibitors of PINs

7 總結與展望

近幾十年的研究表明，PIN 蛋白介導的生長素極性運輸在受重力等環境刺激的器官中產生或維持生長素梯度方面發揮著不可或缺的作用。響應重力刺激后，PIN 的極性定位決定生長素流向的改變，從而形成一種將外部物理信號轉化為生長素誘導的生長反應的機制。

通過20 多年來的分子遺傳學和細胞生物學研究，已建立一個以PIN 蛋白為核心的生長素分布的模型。PIN 蛋白的調控發揮重要作用。PIN 在細胞內會經歷分泌、回收或降解等過程，其中GNOM 起到回收PIN 的作用，且PIN 的磷酸化等翻譯后修飾狀態可以改變PIN 在內膜的分選并進而改變極性定位。盡管在PIN 介導的生長素極性運輸調控方面已有較多的研究，但仍有一些重要的調控機制尚不清楚。例如，PIN 蛋白極化的關鍵決定因素、PIN 本身的細胞行為等。已知GNOM 或GNL1 負責PIN 的回收運輸，但其他因素，如其他ARF 小G 蛋白和Rab 小G 蛋白在此過程中的作用仍待研究［132］。盡管組成型內吞循環和GNOM 介導的極性循環的模型與多種生物過程中的PIN 極化變化一致，但該模型僅來源于BFA 處理實驗，并且尚未在正常條件下觀察到這些過程。在磷酸化和去磷酸化方面，該模型缺乏直接證據來確定磷酸化狀態對于PIN 極性定位還是轉運活性的影響起主導作用。最近一項研究表明，PID可能并不能被簡單地認為通過磷酸化PIN 蛋白而參與生長素途徑和花的發育，而是通過更為復雜的方式參與到PIN 介導的生長素運輸中，相關的分子機制有待于更加深入的研究［133］。此外，還有許多其他相關因素沒有納入該模型，例如，泛素化修飾的PIN 是否被導向液泡進行降解，脂質如PI4P、PI（4,5）P2和PA 的分布是否可以影響PIN 的定位，生長素通過胞間連絲的轉運如何與PIN 介導的轉運進行協作等［134-137］。

植物通過PIN 極性轉換或通過改變PIN 運輸途徑來調節PIN 蛋白豐度的信號通路和機制仍然不完全清楚。利用遺傳學、生物化學、先進成像手段和其他尖端技術的多學科方法將有助于未來的研究，以便更好地理解植物向重力反應中PIN 的極性調控。