系統性紅斑狼瘡患者外周血中γδT細胞及其主要功能亞群的變化及臨床意義

顏云霞, 張卓亞, 黃賽賽, 耿林玉

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 風濕免疫科, 江蘇 南京, 210008)

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性多系統性自身免疫性疾病,其發病是遺傳、表觀遺傳和環境因素的綜合作用[1]。SLE是先天性和適應性免疫系統多種缺陷的結果,包括免疫耐受缺失、T淋巴細胞和B淋巴細胞的過度激活、清除免疫復合物和凋亡細胞的能力下降以及免疫網絡內多種調節機制的失活[2]。根據組成T細胞表面抗原受體(TCR)的2條鏈的不同,可以將T細胞分為αβT細胞和γδT細胞[3]。γδT細胞存在于外周血、腸、皮膚、脾臟和淋巴結中,占總T細胞的5%～10%, 在人外周血中占0.5%～5.0%[4]?；罨摩忙腡細胞表現出多種效應功能,包括針對感染或腫瘤細胞的細胞毒性作用、細胞因子和趨化因子的產生、抗原呈遞功能和調節能力,從而參與一系列疾病過程,包括感染、過敏、自身免疫和癌癥等[5-8]。

與αβT細胞一樣,γδT細胞也表現出Th1-、Th2-、Th17-和Treg樣表型,并在炎癥和免疫耐受中發揮重要作用[9], 目前的研究主要集中在分泌細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-17A(IL-17A)的γδT細胞,可以定義為γδT1、γδT17細胞[10]。γδT細胞參與多種自身免疫疾病的發生發展。1990年,研究[11]證實了γδT細胞在自發性自身免疫應答中的輔助活性。LUNARDI C等[12]采用流式細胞技術檢測了SLE患者和正常人外周血γδT細胞及其亞群,發現SLE患者γδT細胞顯著低于正常人且Vδ2+亞群顯著減少。其他研究[13-14]同樣發現SLE患者外周血中γδT細胞數量減少,其中Vδ2+亞群顯著減少,并且Vδ2+亞群細胞在腎臟中聚集,參與狼瘡腎炎的發生[15]。本研究主要分析SLE患者外周血中γδT細胞及其主要功能亞群γδT1、γδT17細胞的數量變化,并探討其臨床意義,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年7月—2018年10月在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院就診的21例女性SLE患者為SLE組,均符合美國風濕病學會(ACR)1997年修訂的SLE分類診斷標準,并排除感染、腫瘤及其他自身免疫病,年齡14～52歲,平均(34.8±2.5)歲。另選取南京大學醫學院附屬鼓樓醫院體檢中心的16例女性健康人群為健康對照組(HC組),均無風濕病史和風濕病家族史,年齡22～52歲,平均(35.9±2.3)歲。2組年齡、性別比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器

流式抗體為人anti-CD3-Percp/Cy5.5、anti-γδTCR-PE、anti-IFN-γ-APC、anti-IL-17A-APC(美國eBioscience公司); 細胞刺激劑為佛波酯(PMA)、布雷菲德菌素(BFA)、離子霉素(Ionomycin, 美國ENZO公司); 其他試劑包括RPMI 1640培養液、胎牛血清(美國GIBCO公司); BD Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Kit(美國BD公司), Ficoll淋巴細胞分離液(挪威Axis-Shield公司),磷酸鹽緩沖液(PBS, 武漢谷歌生物科技有限公司)。流式檢測采用美國BD公司的BD Calibur流式細胞儀,細胞置于日本SANYO公司的MCO-15AC細胞培養箱中刺激。

1.3 主要溶液配制

胞內因子刺激劑: 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液,同時加入0.1 μg/mL的PMA、1 μg/mL的Ionomycin、5 μg/mL的BFA。R1H溶液: 含1%胎牛血清的RPMI 1640培養液。

1.4 實驗方法

1.4.1 標本采集: 采集空腹SLE組和HC組患者的EDTA抗凝外周血2 mL, 1 500轉/min離心5 min, 棄掉上層血漿,剩余血細胞用于分離外周血單個核細胞。

1.4.2 外周血單個核細胞分離: 將剩余的血細胞采用PBS以1∶1的比例稀釋至3 mL, 然后將稀釋的血細胞緩緩加入3 mL的Ficoll淋巴細胞分離液的上方,置于離心機中以2 000轉/min密度梯度離心20 min, 離心管中由上至下細胞分為4層。第1層為血漿層,第2層云霧狀為單個核細胞層,第3層為透明分離液層,第4層為紅細胞層; 吸取第2層的云霧狀細胞置于新的離心管中,然后加入適量PBS洗滌2次。

1.4.3 流式細胞術檢測外周血γδT細胞及胞內因子表達: 向分離的PBMCs中加入200 μL胞內因子刺激劑,于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育4 h; 1 mL PBS洗滌1次; 加入人anti-CD3-Percp/Cy5.5、anti-γδTCR-PE抗體(R1H溶液1∶300稀釋), 4 ℃避光孵育20 min; l mL R1H溶液洗滌1次; 加入100 μL固定破膜劑, 4 ℃避光孵育20 min; 1 mL BD Wash Buffer洗滌1次; 將PBMCs平均分成2管,分別加入人anti-IFN-γ-APC、anti-IL-17A-APC 抗體(BD Wash Buffer 1∶200稀釋), 4 ℃避光孵育30 min, 1 mL BD Wash Buffe洗滌2次, 200 μL PBS重懸細胞, BD Calibur流式細胞儀檢測,采用FlowJo分析流式細胞術檢測結果。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 SLE患者外周血中γδT細胞、γδT1細胞、γδT17細胞的數量變化

SLE患者外周血γδT細胞占淋巴細胞百分率(γδT細胞比例)為(2.30±1.10)%, 低于HC組的(3.30±1.51)%, 差異有統計學意義(P<0.05); SLE患者外周血γδT1細胞占淋巴細胞百分率(γδT1細胞比例)為(0.93±0.67)%, 低于HC組的(2.09±1.21)%, 差異有統計學意義(P<0.001); SLE患者外周血γδT17細胞占淋巴細胞比率(γδT17細胞比例)為(1.53±2.82)‰, 與HC組的(0.18±0.12‰)相比有增多趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。SLE患者外周血γδT細胞絕對數為(2.88±2.18)×104/mL, 低于HC組的(7.96±3.96)×104/mL, 差異有統計學意義(P<0.000 1); SLE患者外周血γδT1細胞絕對數為(1.20±1.17)×104/mL, 低于HC組的(5.05±3.04)×104/mL, 差異有統計學意義(P<0.000 1); SLE患者外周血γδT17細胞絕對數為(1.03±1.08)×103/mL, 高于HC組的(0.40±0.24)×103/mL, 差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示γδT及其細胞亞群比例及數量變化或參與SLE發生發展。見圖1。

A: SLE組與HC組相關細胞流式圖; B: SLE組與HC組相關細胞水平圖。與HC組比較, *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.000 1。圖1 SLE組(n=21)與HC組(n=16)外周血中γδT細胞、γδT1細胞、γδT17細胞數量比較

2.2 SLE患者外周血γδT細胞、γδT1細胞、γδT17細胞比例及數量與臨床指標的相關性分析

SLE患者外周血中γδT細胞、γδT1細胞比例及絕對數與SLEDAI、紅細胞沉降率、C反應蛋白、24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮、eGFR、補體C3、C4水平均無相關性(P>0.05)。見表1、表2。SLE患者外周血中γδT17細胞比例與SLEDAI(r=0.59,P<0.01)、紅細胞沉降率(r=0.65,P<0.01)呈正相關; γδT17細胞絕對數與SLEDAI(r=0.59,P<0.01)呈正相關,與補體C3水平(r=-0.53,P<0.05)呈負相關,見表3。

表1 SLE患者外周血γδT細胞比例及數量與臨床指標的相關性分析

表2 SLE患者外周血γδT1細胞比例及數量與臨床指標的相關性分析

表3 SLE患者外周血γδT17細胞比例及數量與臨床指標的相關性分析

3 討 論

SLE是一種慢性多系統自身免疫性疾病,具有高度異質性,其發病是遺傳和環境因素的共同作用,機制上主要是由于免疫耐受的缺失以及B細胞和T細胞功能異常[1-2]。γδT細胞在腫瘤和感染中發揮免疫監視和免疫防御的作用,被認為是先天免疫細胞的一員,以主要組織相容性復合物(MHC)非限制的方式迅速識別出外源性病原體和內源性應激誘導配體,例如MHC I類鏈相關分子A/B、UL-16結合蛋白(ULBPs)、熱休克蛋白和人MutS同源蛋白2(hMSH2)[5], 并啟動適應性免疫,作為免疫防御的第一線。ROBAK E等[13]發現SLE患者外周血γδT細胞、Vδ2+亞群、Vγ9+亞群的絕對數顯著低于正常人,但Vδ3+亞群在SLE患者中顯著高于正常人。與未經治療的患者相比,免疫抑制劑治療的患者γδT細胞、Vδ2+亞群、Vγ9+亞群增加1倍,Vδ3+亞群則減少50%,并認為Vδ3+亞群可能與SLE發病相關。LU Z M等[14]通過檢測γδT細胞的增殖及凋亡證實SLE患者外周血中γδT細胞絕對數減少是由于活動性SLE患者的外周γδT細胞表現出更高的凋亡率和較低的增殖能力; 同時,他們還檢測了γδT細胞胞內因子的表達,發現γδT細胞內IFN-γ、IL-4、IL-10和TGF-β的表達升高,表明γδT細胞可以同時分泌促炎因子和抑炎因子而發揮免疫調節作用。YIN S S等[15]發現,新發的SLE患者外周血γδT細胞Vδ2+亞群顯著減少,通過檢測γδT細胞表面趨化因子受體水平,發現部分趨化因子受體在Vδ2+亞群表達顯著高于Vδ1+亞群,且在SLE患者中高于正常人,對狼瘡腎炎患者的腎臟進行免疫組化,可以觀察到明顯的Vδ2+γδT細胞聚集; 經過激素和免疫抑制劑治療后,可以觀察到外周血Vδ2+γδT細胞比例上升,相關趨化因子受體表達減少,表明γδT細胞從外周向腎臟局部的趨化是狼瘡腎炎的發病機制之一。

研究[3]表明γδT細胞可以同時分泌促炎因子和抑炎因子而在SLE的發病中發揮免疫調節作用,并且γδT細胞,尤其是其Vδ2+亞群從外周向腎臟的趨化可能參與了狼瘡腎炎的發病。γδT細胞根據功能可以分為γδT1、γδT17、γδTreg、γδTfh、memory γδT等亞群,其中γδT17細胞在炎癥的免疫應答中發揮了重要作用[16]。在膠原誘導關節炎(CIA)小鼠模型中, γδT細胞數量增加,并通過產生IL-17A加重CIA[17]。真皮中γδT細胞產生IL-17A,并表現出記憶細胞樣特征,導致銀屑病炎癥反復發作[18]。γδT細胞產生的IL-17A促進αβT細胞的發育,在髓過氧化物酶(MPO)抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關腎小球腎炎的發病中發揮重要作用[19]。本研究結果表明,γδT17細胞比例及數量顯著升高,并與SLEDAI、紅細胞沉降率呈顯著正相關,與補體C3水平呈顯著負相關,表明γδT17細胞在SLE發病及疾病活動中發揮了重要作用。既往研究[20]表明SLE患者外周血中IL-17A產生細胞的比例升高,靶組織如腎臟中IL-17A產生細胞的水平升高。SLE患者循環中IL-17A水平也升高。IL-17A能夠誘導SLE的中性粒細胞胞外陷阱形成(NETosis),參與SLE發病[21]。IL-17A還可以誘導不同類型細胞產生促炎細胞因子,如巨噬細胞和單核細胞產生IL-6。IL-6促進B細胞向漿細胞的分化,并產生自身抗體[22]。IL-17A誘導B細胞的存活、增殖和分化,產生自身抗體[23]。

研究[24]表明, γδT細胞與其他免疫細胞之間存在復雜的相互作用,這對于SLE的發病機制至關重要。γδT細胞的活化可以促使B細胞上調表達TLR7和TLR9、CD40等,促進B細胞的活化和抗體產生。不僅如此,SLE患者外周血γδT17細胞增多,可能通過產生IL-17A誘導B細胞活化產生自身抗體,誘導單核巨噬細胞產生IL-6等促炎細胞因子,誘導NETosis產生等機制,參與SLE的發病。本研究發現SLE患者外周血中γδT細胞比例及數量顯著下降,主要是由于其γδT1細胞亞群減少導致γδT1細胞在SLE中減少,可能與免疫調節失衡、自身抗體的作用、炎癥因子的影響以及調控機制的異常有關。最新研究[25]表明,抗CD3自身抗體可以通過與γδT1細胞的受體結合,抑制或破壞γδT1細胞的功能和存活,從而導致其減少。此外,炎癥因子如IL-23的過度產生可誘導γδT17細胞分化,并抑制γδT1細胞的發育和功能,導致其減少[26]。

綜上所述, SLE患者外周血中γδT細胞數量顯著下降,這主要由其γδT1細胞亞群減少所致,γδT17與SLE病情活動指數如SLEDAI、補體C3等顯著相關,提示γδT17細胞亞群在SLE發病中發揮著關鍵作用。