基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測(cè)裝置

毛 敏，高志忠，張如超，陳宇杰，劉文琮，張南剛，2

（1.武漢紡織大學(xué)電子與電氣工程學(xué)院，湖北武漢 430200；2.智能微納醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)裝備及關(guān)鍵技術(shù)湖北省工程研究中心，湖北武漢 430200）

血液凝固檢測(cè)是心腦血管及血栓類疾病的重要檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)于患者的早期檢查、術(shù)前風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估[1]、抗凝藥物口服[2]都有著重要的指導(dǎo)意義。在臨床情況下，精確控制血液凝固和快速逆轉(zhuǎn)抗凝治療都至關(guān)重要[3]。凝血酶原時(shí)間（PT）是血凝四項(xiàng)之一，廣泛應(yīng)用于臨床診斷。該項(xiàng)血凝檢測(cè)指標(biāo)可用于監(jiān)測(cè)患者術(shù)前、圍術(shù)期和術(shù)后血凝狀態(tài)[4]，指導(dǎo)患者接受抗凝治療，調(diào)節(jié)血凝狀態(tài)[5]。該指標(biāo)對(duì)患者的輸血指導(dǎo)[6]、創(chuàng)傷性凝血功能障礙的緊急管理、血栓防治[7]、出血量控制和靶向止血治療[8]有重要意義。傳統(tǒng)的血凝檢測(cè)是按固定的時(shí)間間隔訪問(wèn)醫(yī)院，通過(guò)臺(tái)式設(shè)備進(jìn)行PT 檢測(cè)。這種做法既費(fèi)時(shí)又昂貴，檢測(cè)不及時(shí)可能帶來(lái)不幸的后果[9]。基于微流控技術(shù)的診斷儀器有微型化和集成化的特性，高度契合POCT 的發(fā)展需求，基于微流控技術(shù)的血凝檢測(cè)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[10]。該文選擇具有高透氣性且透氣速率穩(wěn)定的PDMS 材料[11]，通過(guò)微加工工藝制作出一種用于血凝檢測(cè)的微流控芯片，再依托嵌入式技術(shù)、圖像采集與分析技術(shù)，研制了基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測(cè)裝置。

1 裝置整體設(shè)計(jì)

該裝置由主控模塊、屏幕模塊、圖像采集模塊、負(fù)壓發(fā)生模塊組成。檢測(cè)裝置整體設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 裝置整體設(shè)計(jì)

主控模塊是整個(gè)系統(tǒng)的核心，通過(guò)插接件與其他模塊連接。其主要功能是控制其他各模塊實(shí)現(xiàn)功能，保證整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行。

屏幕模塊的主要功能是通過(guò)觸摸屏顯示GUI 界面來(lái)實(shí)現(xiàn)與人的觸摸交互。屏幕模塊使用800×480分辨率的5 英寸IPS 屏幕面板，使用并行的24 位RGB接口。觸摸屏幕芯片為GT911，使用的通信接口為IIC。GT911 所允許的最大通信頻率為400 kHz，IIC時(shí)鐘線和IIC 數(shù)據(jù)線接了一個(gè)RC 低通濾波器，用以濾除高頻干擾。驅(qū)動(dòng)單片機(jī)外設(shè)的LTDC 屏幕驅(qū)動(dòng)器的硬件初始化，通過(guò)LTDC 驅(qū)動(dòng)RGB565 制式的LCD 屏幕顯示相應(yīng)內(nèi)容。檢測(cè)裝置運(yùn)行界面如圖2所示。

圖2 檢測(cè)裝置運(yùn)行界面示意圖

圖像采集模塊包含攝像頭、變焦鏡頭和補(bǔ)光燈。攝像頭對(duì)微流控芯片進(jìn)行圖像采樣，將采集所得的圖像傳入主控模塊。變焦鏡頭則負(fù)責(zé)圖像采集范圍和焦點(diǎn)的控制。補(bǔ)光燈在攝像頭采集數(shù)據(jù)時(shí)進(jìn)行補(bǔ)光，輔助合適顏色、亮度的光線，以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量圖像采集。圖像采集的準(zhǔn)確性決定了裝置檢測(cè)的精確度。裝置所使用攝像頭的快門速度與采樣增益均是可控的，再搭配補(bǔ)光燈，構(gòu)建了一整套圖像采集系統(tǒng)。傳感器曝光時(shí)間、傳感器采樣增益和補(bǔ)光燈強(qiáng)度三者共同決定了采集圖片的曝光度。過(guò)高或過(guò)低的曝光度都會(huì)使得圖像數(shù)據(jù)失真，合理曝光的圖像才滿足檢測(cè)條件。攝像頭驅(qū)動(dòng)程序通過(guò)SCCB 總線協(xié)議完成對(duì)攝像頭傳感器與內(nèi)置DSP（Digital Signal Processing）的初始化，實(shí)現(xiàn)單片機(jī)DCMI 接口的硬件初始化，通過(guò)DCMI 數(shù)據(jù)接口實(shí)現(xiàn)對(duì)攝像頭位圖數(shù)據(jù)、幀中斷的讀取，進(jìn)而將完整圖像數(shù)據(jù)傳回主控芯片，用于后續(xù)數(shù)據(jù)的處理。補(bǔ)光燈驅(qū)動(dòng)程序?qū)崿F(xiàn)了WS2812 芯片的驅(qū)動(dòng)，通過(guò)DMA 總線搬運(yùn)數(shù)據(jù)、SPI 總線發(fā)送數(shù)據(jù)，完成對(duì)搭載WS2812 芯片的LED 燈珠的亮度、色彩控制，為攝像頭采集過(guò)程補(bǔ)光。變焦鏡頭可根據(jù)采樣范圍進(jìn)行位置調(diào)整，可以等比例的縮放所拍攝區(qū)域的像素，以適配檢測(cè)區(qū)域的尺寸。攝像頭、變焦鏡頭及補(bǔ)光燈結(jié)構(gòu)布局如圖3 所示。

圖3 圖像采集模塊結(jié)構(gòu)布局圖

負(fù)壓發(fā)生模塊包括負(fù)壓泵和導(dǎo)氣機(jī)構(gòu)。通過(guò)A4988 驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)42H48 步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，結(jié)合光電傳感器完成負(fù)壓泵的復(fù)位和運(yùn)動(dòng)控制，實(shí)現(xiàn)任意速度的運(yùn)動(dòng)和任意位置的啟停，配合注射器為微流控芯片提供負(fù)壓源。導(dǎo)氣機(jī)構(gòu)通過(guò)驅(qū)動(dòng)伺服舵機(jī)帶動(dòng)硅膠氣嘴伸縮實(shí)現(xiàn)導(dǎo)氣機(jī)構(gòu)與血凝檢測(cè)芯片導(dǎo)氣嘴的接合與分離。導(dǎo)氣機(jī)構(gòu)滿足了微流控芯片與負(fù)壓泵的快速替換，同時(shí)保證接合的穩(wěn)定性，為負(fù)壓提供一個(gè)穩(wěn)定的氣體通路。通過(guò)3D 建模、打印、組裝及調(diào)試，血凝檢測(cè)裝置實(shí)物如圖4 所示。

圖4 血凝檢測(cè)裝置實(shí)物圖

2 微流控血凝檢測(cè)芯設(shè)計(jì)與制作

該裝置所使用微流控血凝檢測(cè)芯片是自主設(shè)計(jì)和制作的。該芯片具有兩個(gè)功能區(qū)域：血凝樣本檢測(cè)區(qū)和叉指負(fù)壓區(qū)。檢測(cè)區(qū)微通道處于上層玻璃中，負(fù)壓區(qū)微通道處于底層PDMS 中，通過(guò)鍵合工藝實(shí)現(xiàn)整個(gè)芯片的裝配。檢測(cè)區(qū)為蛇形通道，供檢測(cè)樣本在負(fù)壓驅(qū)動(dòng)下流動(dòng)；負(fù)壓區(qū)為叉指型微通道，由于PDMS 具有較好的透氣性和穩(wěn)定的透氣速率，當(dāng)一側(cè)叉指通道與負(fù)壓泵相連時(shí)，與檢測(cè)區(qū)相連的另一側(cè)叉指通道中在較短時(shí)間內(nèi)將產(chǎn)生一個(gè)穩(wěn)定的負(fù)壓，可用于穩(wěn)定地驅(qū)動(dòng)檢測(cè)區(qū)微通道中血液的流動(dòng)。芯片結(jié)構(gòu)示意圖如圖5 所示。

圖5 芯片結(jié)構(gòu)示意圖

血凝樣本檢測(cè)區(qū)微通道寬度為500 μm，高度為100 μm，蛇形通道總長(zhǎng)度約為160 mm，樣本檢測(cè)區(qū)通道的內(nèi)部體積很小，減少了PT 檢測(cè)所需的血樣用量和試劑用量。降低了檢測(cè)成本。叉指負(fù)壓區(qū)微通道寬度為400 μm，高度為100 μm，相鄰叉指微通道間隔為160 μm。叉指結(jié)構(gòu)可以更好的利用PDMS 材料的透氣性。

3 凝血酶原時(shí)間測(cè)試

3.1 檢測(cè)原理及方法

血液凝固是一種動(dòng)態(tài)的血液活動(dòng)[12]，在凝固過(guò)程中，可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白，血液在形態(tài)學(xué)上將發(fā)生變化，逐漸由流動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢闪鲃?dòng)的凝膠態(tài)。凝血酶原時(shí)間檢測(cè)原理是將待測(cè)樣本加入過(guò)量的含鈣組織凝血活酶，重新鈣化的血漿在存在組織因子時(shí)，激活因子X成為Xa，后者使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶[13]。凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，在恒定的負(fù)壓驅(qū)動(dòng)下，待測(cè)血樣將在檢測(cè)區(qū)微通道中流動(dòng)，隨著血液黏度變大，流動(dòng)速度逐漸降低，最后停止流動(dòng)。測(cè)定整個(gè)凝固的時(shí)間即為待測(cè)樣本的凝血酶原時(shí)間(PT)。

采用攝像頭對(duì)整個(gè)血凝過(guò)程進(jìn)行圖像采集，然后對(duì)獲得的圖像進(jìn)行分析處理，即可解析出PT 值。圖像處理過(guò)程如下：先將采集的圖像轉(zhuǎn)為灰度圖像；然后轉(zhuǎn)為二值圖像；進(jìn)而對(duì)圖像像素進(jìn)行識(shí)別，得出色度占比結(jié)果；最后通過(guò)解析色度占比曲線來(lái)確定檢測(cè)起點(diǎn)和終點(diǎn)。

血液流經(jīng)區(qū)域在二值圖像內(nèi)顯示為黑色占比為P1，血液未流經(jīng)區(qū)域在二值圖像內(nèi)顯示為白色占比為P2，可定義色度占比為P0=P1（/P1+P2）。通過(guò)繪制色度占比曲線（即凝固曲線），再利用一階求導(dǎo)法即可確定凝固終點(diǎn)時(shí)間。

3.2 PT測(cè)定實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

取某同學(xué)血樣作為標(biāo)準(zhǔn)樣本，開展了兩組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PT 測(cè)試實(shí)驗(yàn)；1）實(shí)驗(yàn)組：血樣+凝血檢測(cè)試劑；2）對(duì)照組：純血樣。

所用檢測(cè)試劑是凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒（凍干型，凝固法），每瓶凝血酶試劑都應(yīng)以瓶體標(biāo)識(shí)體積添加緩沖液，輕輕搖動(dòng)溶解，復(fù)溶后的試劑在-2～8 ℃環(huán)境下可保存7 天；采用含有1/10 體積0.109 mol/L 枸櫞酸鈉抗凝液[14-15]的塑料管或硅化玻璃管作為儲(chǔ)血容器進(jìn)行靜脈采血[16]，采集后輕輕顛倒8 次將血樣與緩沖液混勻，在此過(guò)程中應(yīng)避免溶血及組織液污染[17]。樣本在-2～8 ℃保存時(shí),不宜超過(guò)6 h；22～24 ℃保存時(shí),不宜超過(guò)2 h[18]。裝置開機(jī)后設(shè)置相關(guān)參數(shù)；裝入血凝檢測(cè)芯片，點(diǎn)擊“開始測(cè)試”按鈕，硅膠吸盤氣嘴在舵機(jī)控制下與導(dǎo)氣孔緊密連接，至此等待裝置負(fù)壓建立完畢；屏幕提示可以開始注樣時(shí)，取37 ℃預(yù)熱的凝血檢測(cè)試劑0.2 mL 與37 ℃預(yù)熱3 min的待測(cè)血樣0.1 mL加入塑料中，應(yīng)當(dāng)注意，凝血酶試劑預(yù)溫不可超過(guò)15 min，血樣預(yù)溫不宜超過(guò)5 min；將二者輕微攪拌混合；然后將混勻后的待測(cè)樣本加入血凝檢測(cè)芯片進(jìn)樣孔；然后啟動(dòng)攝像頭全程采集檢測(cè)區(qū)圖像；經(jīng)圖像處理后繪制出的色度占比曲線如圖6 所示，然后利用一階求導(dǎo)法對(duì)圖6 所示曲線進(jìn)行解析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組PT 值約為12.8 s，而對(duì)照組PT 值趨近于無(wú)窮大。

圖6 色度占比曲線

4 結(jié)束語(yǔ)

該文提出了一種基于微流控芯片的POCT 化血凝檢測(cè)技術(shù)，并完成了微流控芯片及檢測(cè)裝置的設(shè)計(jì)和制作，最后利用血樣標(biāo)本在該裝置上完成了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組凝血酶原時(shí)間的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該文創(chuàng)新性地將負(fù)壓抽取技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了POCT 化的血凝檢測(cè)，再結(jié)合嵌入式技術(shù)、圖像采集和分析技術(shù)研發(fā)出高度集成化的裝置。該裝置具有體積小巧、便于攜帶、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、檢測(cè)效率高和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可供基層社區(qū)醫(yī)院使用或者患者居家自測(cè)，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。