1-磷酸鞘氨醇受體3 對脂多糖處理大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響

吳晉，應靜

膿毒癥相關急性腎損傷（sepsis-associated acute kidney injury，S-AKI）是指原無腎損傷的患者在發生膿毒癥后出現包括血、尿指標異常，以及組織學或影像學可見的實質性腎損傷[1-2]。與其他病因引起的AKI 相比，S-AKI 死亡風險高出6 ～8 倍[3]。1-磷酸鞘氨醇受體（sphingosine-1-phosphate receptor，S1PR）是一類七次跨膜的G 蛋白偶聯受體，與1-磷酸鞘氨醇結合，啟動細胞跨膜信號轉導效應。S1PR3作為S1PRs 家族中一個主要成員，在成年鼠以及人體多種器官、組織和細胞中廣泛表達[4]。本研究用脂多糖（LPS）處理大鼠腎小管細胞來建立S-AKI 細胞模型，觀察S1PR3 動態變化，來探討S1PR3 介導的信號通路在S-AKI 上的作用及機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 大鼠腎小管細胞（NRK-52E）購自上海中科院細胞庫。試劑主要有DMEM/F12 細胞培養液（美國Gibco 公司），LPS（美國SIGMA 公司），S1PR3 激動劑KRX-725（上海吉爾生化有限公司），青霉素鈉、硫酸鏈霉素（大連美侖生物），CCK8試劑盒、Annexin V-FITC/PI apoptosis kit、Goat anti-Mouse IgG、Goat anti-Rabbit IgG、-Actin（杭州聯科生物公司），0.45m PVDF 膜（Millipore 公司），彩色預染蛋白分子量標準（Fermentas 公司），ECL Plus 發光試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（×5）、Western 及IP 細胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、GreenNuc?活細胞caspase-3 活性檢測試劑盒（碧云天公司），ELISA檢測試劑盒（江萊生物公司），鈣離子檢測試劑（美國Molecular Probes 公司）。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養箱3111 型（Thermo 公司），倒置顯微鏡IX73 型（Olympus 公司），全波長酶標儀SpectraMax Plus 384 型（美國MD），流式細胞儀（美國BD 公司），渦旋振蕩儀QL-861 型（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），電泳系統、凝膠成像儀（美國Bio-RAD 公司），移液器（德國Eppendorf 公司），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器公司），臺式低速離心機（湖南凱達實業公司），微光分光光度計（美國Merinton 公司）。

1.2 方法

1.2.1 NRK-52E 細胞培養 NRK-52E 細胞株常規培養在含有5%胎牛血清和1×青鏈霉素的DMEM/F12 中，培養條件為37 ℃、5%CO2的濕潤無菌環境，每4 ～5 天換液傳代1 次。

1.2.2 建立膿毒癥細胞模型 將NRK-52E細胞分為對照組及LPS 組。對照組為空白組，不予處理。LPS組予LPS（20g/ml）刺激不同時間（12、24 及36h）后分別離心收集待檢。上述細胞分組收集好后做CCK8 檢測細胞活力，篩選出最佳LPS 作用時間（刺激12 h）。

1.2.3 實驗分組及預處理 將細胞分為對照組、LPS組、S1PR3 激動劑+LPS 組。對照組不予處理；LPS 組予LPS（20g/ml）刺激12h后做離心收集待檢；S1PR3激動劑+LPS 組先用S1PR3 激動劑KRX-725 預處理2h后再予LPS（20g/ml）刺激12h后做離心收集待檢。

1.2.4 流式細胞術檢測NRK-52E 細胞凋亡差異各組取培養好NRK-52E 細胞，以3×105/孔接種于6孔板中，按各組要求做好預處理后，用無EDTA的胰酶消化離心收集細胞，1×PBS 洗滌細胞兩次（1 000 r/min，離心時間5 min 收集細胞），用500l 1×Binding Buffer 懸浮細胞，在細胞懸浮液中加入5l Annexin V-FITC 和10l PI，并設置單染管，輕輕混勻后于4 ℃避光條件下孵育5 min，上機檢測。

1.2.5 Western Blot 檢測S1PR3 蛋白表達 將細胞分組并預處理后加入細胞裂解液，分別離心提取總蛋白。將樣品加入5×上樣緩沖液混勻，100 ℃放置10 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道約30g，在10%SDS-PAGE凝膠中電泳后電轉于硝化纖維素薄膜上。封閉、PBS 洗膜3 次后加入相應的一抗，4℃孵育過夜，洗膜3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。PBS 洗膜3 次后應用化學發光系統顯色凝膠成像儀放射自顯影，并分析電泳條帶的灰階密度值。

1.2.6 流式細胞術檢測NRK-52E 細胞鈣離子表達取培養好的細胞，以3×105/孔接種于6 孔板中，按各組要求做好預處理后，用無EDTA 的胰酶消化離心收集細胞，1×PBS 洗滌細胞兩次（1 000 r/min，離心時間5 min 收集細胞），用培養基重懸細胞，DMSO溶解Fluo4-AM 母液，使用時用PBS 稀釋1 000 倍加入裝有細胞的EP 管中，37 ℃，避光30 min；離心500 g，5 min，棄掉上清，PBS 重懸細胞，上機檢測。

1.2.7 ELISA 檢測Calpain 1 及Calpain 2 的表達取培養好的細胞，按照Calpain 1、Calpain 2 ELISA試劑盒說明書操作，用全自動酶標儀測定450 nm 波長處的OD 值，通過繪制標準曲線得出的濃度。

1.2.8 流式細胞術檢測NRK-52E 細胞caspase-3 表達 取培養好的細胞，以3×105/孔接種于6 孔板中，按各組要求做好預處理后，用無EDTA 的胰酶消化離心收集細胞，1×PBS 洗滌細胞兩次（1 000 r/min，離心時間5 min 收集細胞），用培養基重懸細胞，使細胞濃度在106/ml；吸取200l 于流式檢測管，加入1l 的底物，立即混勻使底物濃度為5mol/L，室溫避光孵育30 min，加入300l培養基，上機檢測。

1.3 統計方法 采用GraphPadPrism 統計軟件，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用F 檢驗，多重比較采用LSD-t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NRK-52E細胞凋亡率比較 NRK-52E細胞凋亡率對照組為（1.99±0.35）%，LPS 組為（13.50±0.69）%，S1PR3 激動劑+LPS 組為（21.69±0.81）%，3 組差異有統計學意義（F=2107.60，P ＜0.05），其中LPS 組明顯高于對照組（t=44.63，P ＜0.05），S1PR3 激動劑+LPS 組明顯高于LPS 組（t=23.09，P ＜0.05）。

2.2 NRK-52E 細胞 S1PR3 蛋白表達比較 NRK-52E 細胞S1PR3 蛋白灰度值比值對照組為0.39±0.11，LPS組為0.78±0.07，S1PR3激動劑+LPS組為0.92±0.04，3 組差異有統計學意義（F=36.50，P＜0.05），其中LPS 組明顯高于對照組（t=5.18，P ＜0.05），S1PR3 激動劑+LPS 組明顯高于LPS 組（t=3.01，P ＜0.05），見圖1。

圖1 3 組Western Blot 檢測S1PR3 蛋白表達電泳條帶

2.3 NRK-52E 細胞鈣離子表達比較 NRK-52E 細胞鈣離子表達相對熒光強度對照組為100.00±6.14，LPS 組為371.43±11.20，S1PR3 激動劑+LPS 組為604.36±7.09，3 組差異有統計學意義（F=8061.53，P＜0.05），其中LPS組明顯高于對照組（t=63.75，P＜0.05），S1PR3 激動劑+LPS 組明顯高于LPS 組（t=52.72，P ＜0.05）。

2.4 NRK-52E 細胞Calpain 1 及Calpain 2 表達LPS 組Calpain 1 及Calpain 2 水平明顯高于對照組（t=38.37、45.06，均P ＜0.05），S1PR3 激動劑+LPS 組Calpain 1 及Calpain 2 水平明顯高于LPS 組（t=13.79、58.60，均P ＜0.05），見表1。

表1 3 組Calpain 1 及Calpain 2 表達水平比較 ng/ml

2.5 NRK-52E 細胞caspase-3 表達比較 NRK-52E細胞 caspase-3 表達相對熒光強度，對照組為100.00±3.55，LPS 組為357.05±8.99，S1PR3 激動劑+LPS 組為666.36±24.88，3 組差異有統計學意義（F=3047.71，P ＜0.05），其中LPS 組明顯高于對照組（t=79.78，P ＜0.05），S1PR3 激動劑+LPS 組明顯高于LPS 組（t=35.08，P ＜0.05）。

3 討論

S-AKI 是危重患者不良預后的獨立危險因素，與非膿毒癥致AKI及單純膿毒血癥患者相比，S-AKI患者死亡率顯著增加[5]。筆者以往研究采用盲腸結扎穿刺術建立了膿毒癥小鼠模型，發現膿毒癥小鼠出現了明顯的腎臟損傷，存活率顯著下降[6-7]。本研究結果顯示，在細胞層面上同樣觀察到膿毒癥NRK-52E 細胞模型凋亡率顯著增加。

膿毒癥造成腎臟損傷機制還不完全明了，認為與炎性介質、凝血功能異常、腎缺血再灌注、內毒素、細胞壞死和細胞凋亡等因素有關。Sun 等[8]發現，患有膿毒癥相關的急性呼吸窘迫綜合征的患者體內S1PR3 啟動子發生變異，導致S1PR3 蛋白表達下降。還有研究認為S1PR3 是參與膿毒癥過程巨噬細胞清除細菌的關鍵分子，具有雙面性，既能夠增強巨噬細胞體氧依賴和非氧依賴殺菌能力，從而增強膿毒癥小鼠抗感染能力，改善生存率；也能通過拮抗S1PR3 來抑制肺巨噬細胞的核因子NF- B 的活性，下調肺巨噬細胞炎癥反應水平，從而起到膿毒癥肺保護的作用[9-10]。Sammani 等[11]認為在LPS 介導的膿毒癥急性肺損傷模型中，過度活化的S1PR3 會促進肺泡或血管內皮細胞通透性增加，加重肺的炎性損傷，而敲除S1PR3 則使內皮細胞通透性降低。因此以S1PR3 為基因靶點的個體化治療膿毒癥及相關的并發癥具有重要臨床意義，但是S1PR3 在S-AKI 上的作用及其機制，目前國內外尚未見到相關報道。

本研究結果顯示，與對照組相比，LPS組細胞凋亡率顯著增加，S1PR3 表達顯著增加，說明膿毒癥細胞模型建立成功，且膿毒癥NRK-52E 細胞中S1PR3的表達是顯著增加的。經過S1PR3 激動劑預處理后，膿毒癥NRK-52E 細胞內S1PR3 蛋白表達水平顯著增加，細胞凋亡率顯著增加，說明S1PR3 過度激活后能加重細胞凋亡。

研究認為，S1PR3 激活能引起血管平滑肌細胞內鈣離子濃度上升[12-13]，而使用S1PR3 阻斷劑TY-52156 可以抑制細胞內鈣離子濃度上升[14]。細胞內微摩爾級濃度的鈣離子可以激活鈣依賴性蛋白酶Calpain-1，毫摩爾級濃度的鈣離子可以激活Calpain-2。Calpains 參與機體多種細胞的凋亡[15-16]。激活Calpain-1 可直接降解caspase-12，進而激活細胞凋亡最終執行環節的關鍵分子caspase-3，引起細胞凋亡[17]。激活的Calpain-1 還可以剪切促凋亡因子Bid使之激活，Bid活性增加，破壞了與抗凋亡因子Bcl-2的平衡，通過激活線粒體凋亡通路引起凋亡[18]。在腎細胞中，caspase-3 的激活需要Calpains-1、2 作用。使用鈣依賴性蛋白酶抑制劑處理，可以減少腎小管細胞的死亡率和caspase-3 的活性[19]。因此Calpains-1、2 可能位于caspase-3 細胞凋亡的信號通路的上游。本研究發現，相比于對照組，LPS 組細胞內S1PR3 表達顯著增加，鈣離子濃度顯著增加，Calpain 1、Calpain 2 水平以及凋亡關鍵蛋白caspase-3 活性顯著升高；而隨著加入S1PR3 激動劑后，S1PR3 進一步激活，表達增加，導致膿毒癥NRK-52E 細胞內鈣離子濃度又繼續增加，Calpain 1、Calpain 2 水平以及caspase-3 活性繼續升高，最終表現為細胞凋亡又進一步加重。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 吳晉：實驗操作、論文撰寫、數據整理、統計學分析；應靜：研究指導、論文修改、經費支持