CKMT2 對結直腸癌發生發展的影響

蔡莎莎，喻長法，段達榮，劉炳輝，廖南生，陳文曉

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種消化系統惡性腫瘤，它的發病率和死亡率在全世界惡性腫瘤中排名第三位，已成為困擾全球的主要健康問題之一[1-2]。十余年來，我國CRC 的發病率與死亡率持續攀升[3-4]，給社會及醫療機構帶來沉重的壓力。隨著腫瘤標志物、腸鏡等篩查手段的進展以及CRC根治手術的不斷改進，早期CRC患者的5 年生存率得到大大改善，但是大多數患者診斷時已處于中晚期階段，預后較差。肌酸激酶線粒體2（creatine kinase mitochondrial 2，CKMT2），屬于肌酸激酶（creatine kinase，CK）同工酶家族[5-6]。本研究旨在分析CKMT2在CRC 組織中的表達，探討其與CRC 發生發展的關系及其可能調控機制，為CRC早期腫瘤標志物的篩選提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018 年1 月至2022 年12 月于臺州市第一人民醫院行手術治療的149 例CRC患者。收集其腫瘤組織和遠端癌旁組織標本，各自放入凍存管，然后迅速置于液氮環境中，保存至-80℃。本研究獲得臺州市第一人民醫院倫理委員會批準，所有研究者均同意參加本研究并簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和細胞轉染 對人CRC 細胞株SW480 及其對照細胞株NCM460（上海富恒生物科技有限公司）進行培養，達到80%左右細胞密度，使用Lipo3000 和Opti-MEM 培養基進行轉染（賽默飛世爾科技公司）。轉染分組：轉染陰性對照NC siRNA的為NC 組（對照組），轉染CKMT2 siRNA 的為siCKMT2 組（上海吉瑪公司）。轉染48 h 后，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法驗證轉染效果。

1.2.2 qRT-PCR 組織標本研碎或者收集細胞，提取總RNA；再進行逆轉錄反應合成cDNA，最后以cDNA 為模板，采用美國Applied Biosystems 7300 plus 實時熒光定量PCR 儀檢測mRNA 表達水平（TaKaRa 公司）。CKMT2 引物序列為：上游5’-ACGAGGCTGGGAGTTCAT-3’，下游5’-CACGCTT CTGGAGTCTTAGGTT-3’；Myc 引物序列為：上游5’-GGCTTTATCTAACTCGCTGTA-3’，下游5’-TA TGGGCAAAGTTTCGTG-3’。

1.2.3 Western Blot 收集處理后的細胞，并提取總蛋白，蛋白濃度調整至1g/l。再用上海碧云天生物技術有限公司的試劑盒檢測。相關抗體購自Abcam 公司。

1.2.4 免疫共沉淀 在細胞處理完畢后，使用含有1 mmol/L 的PMSF、1%蛋白磷酸酶抑制劑混合物的Co-IP 細胞裂解緩沖液，并在冰上裂解細胞30 min。再將裂解液離心，收集上清液，加入30l 蛋白A/G CoIP 磁珠，4 ℃緩慢搖晃30 min。然后收集上清液，加入兔抗CKMT2、小鼠抗Myc 抗體孵育，4℃緩慢搖晃孵育過夜。之后加入30l 蛋白A/G CoIP 磁珠，4 ℃緩慢搖晃4 h，收集磁珠并用裂解緩沖液清洗3 次，1×SDS上樣緩沖液洗脫，100 ℃加熱5 min，然后進行Western Blot 檢測。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。非正態分布的計量資料以中位數（四分位間距）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；計數資料比較采用2檢驗或Fisher’s檢驗；借助Kaplan-Meier法生成生存曲線。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CKMT2 在結直腸癌中的表達 149 例結直腸癌組織中CKMT2 mRNA 表達水平[3.72（1.93，8.61）]明顯高于癌旁組織[1.12（0.61，1.75）]，差異有統計學意義（Z=10.421，P ＜0.05）；CRC 細胞株中CKMT2 mRNA 的表達水平明顯高于對照細胞株（t=17.69，P ＜0.05），見圖1。

圖1 CKMT2 在CRC 中的表達

2.2 CKMT2 表達水平與CRC 患者臨床病理特征的關系 根據CKMT2 表達水平是否高于表達中位數，分為≤中位數組和＞中位數組。兩組年齡、性別、腫瘤部位、病理類型、分化程度和TNM 分期差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 不同CKMT2 水平患者的臨床特征 例

2.3 CKMT2 與結直腸癌患者生存結局的關系 對納入患者進行隨訪，隨訪截止時間為2023 年6 月30日，根據中位數將CKMT2 分為＞中位數組和＜中位數組，用Kaplan-Meier 方法生成生存曲線。結果顯示CKMT2 ＞中位數組與＜中位數組比較，總體生存率明顯降低（P ＜0.05），見圖2。

圖2 CKMT2 不同表達水平患者總體生存率比較

2.4 CKMT2 正向調控Myc的表達 通過使用qRTPCR技術對來自25 例CRC患者的臨床組織樣本進行研究，發現結直腸癌組織Myc 基因表達量[14.56（4.06，52.72）]明顯高于周圍正常組織[1.30（0.25，3.47）]，差異有統計學意義（Z=4.084，P ＜0.05），見圖3A。Spearman 相關性分析揭示出，CRC 組織中CKMT2 的表達水平與Myc 表達水平呈正相關（r=0.478，P ＜0.05），見圖3B。

圖3 結直腸癌患者Myc 表達水平及其與CKMT2 表達水平的相關性

2.5 細胞轉染 結直腸癌細胞株SW480 轉染siCKMT2 后，qRT-PCR 法檢測siCKMT2 轉染效果，結果發現siCKMT2 組的CKMT2 mRNA 表達水平明顯低于NC 組（t=5.011，P ＜0.05），表明siCKMT2 轉染有效。在此基礎上檢測siCKMT2 組和對照組Myc的表達水平，結果發現siCKMT2 組Myc 的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=4.520，P＜0.05），見圖4A。Western blot 顯示，Myc 蛋白在轉染siCKMT2 后也顯著下調，見圖4B。

圖4 SW480 細胞株轉染siCKMT2 后Myc 表達水平

2.6 免疫共沉淀結果 在SW480 細胞內，可以從CKMT2 的免疫沉淀產物中檢測到Myc 蛋白，同時也可以在Myc 的免疫沉淀產物中發現CKMT2 蛋白。對于IgG 的免疫沉淀產物，無論是CKMT2 還是Myc 都無法被檢出，見圖5。

圖5 免疫共沉淀方法檢測CKMT2 與Myc的結合情況

3 討論

CKMT2 基因位于人類染色體5q13.3，是一種線粒體肌酸激酶，廣泛分布于細胞線粒體內膜和外膜間隙，主要參與細胞內能量轉運、肌肉收縮、丙酮酸代謝、三磷酸腺苷合成等生物學過程[7]。Wang 等[8]鑒定了骨肉瘤中3 856 個差異表達基因和250 個顯著表達的microRNAs，發現CKMT2 與抑癌基因p53、表皮生長因子受體（EGFR）、基質金屬蛋白酶（MMP）等相關，通過調控血管生成、遷移和侵襲參與骨肉瘤的生長發育。Ye 等[9]根據癌癥基因組圖譜（TCGA）407 個樣本和（GEO）數據庫433 個樣本的數據，構建了包含CKMT2 在內的13 個代謝相關基因的預后模型，用于胃腺癌（STAD）的預后預測。有學者研究了CKMT2 在18 例結直腸癌患者中的表達，通過二維液相色譜-質譜聯用分析、Western Blot、免疫組化分析驗證了CKMT2 在結直腸癌中的高表達[10]。本研究通過使用qRT-PCR 技術對來自149 例CRC組織的標本進行數據分析，發現癌組織CKMT2 mRNA 表達水平明顯高于癌旁組織（P ＜0.05）；且研究發現CKMT2 高水平組的總體生存率明顯降低（P ＜0.05），說明CKMT2 與患者生存結局有關，能提示CRC 患者預后。

原癌基因Myc 編碼一個轉錄因子家族，是人類腫瘤中最常見的活化癌蛋白之一。在人類絕大多數癌癥中都會發生Myc 異?；蛘吲cMyc 途徑相關的上調機制。Myc 蛋白是細胞程序的主要調節因子，在腫瘤相關的多種生物學功能中發揮調控作用[11-12]。常琳[13]研究發現，LINC00941 通過影響miR-205-5p的表達，正向調控Myc 的表達，從而促進結腸腫瘤的發生和進展。Jing 等[14]的研究發現，凝縮蛋白復合物II 亞基D3（NCAPD3）通過上調c-Myc 的水平，并與c-Myc相互作用，增強了細胞的有氧糖酵解（Warburg 效應），從而影響結直腸癌的發生發展。本研究發現，CKMT2 表達水平與Myc 表達水平呈正相關（r=0.478，P＜0.05）；轉染siCKMT2 后，qRT-PCR和Western blot 檢測發現CRC 細胞株中Myc mRNA 和Myc 蛋白水平均下降，提示CKMT2 正向調控Myc。本研究還采用免疫共沉淀方法驗證了CKMT2 與Myc 之間的相互作用關系，進一步證實了CKMT2通過Myc 調控結直腸癌的可能機制。

綜上所述，本研究揭示了CKMT2 在CRC 組織和細胞系中的表達水平均升高，高水平的CKMT2 可能預示患者的不良預后，CKMT2 可能通過促進Myc對結直腸癌的發生和進展起到調控作用。CKMT2可能成為一個新的生物標志物和治療靶點。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 劉炳輝：實驗操作；蔡莎莎、喻長法：論文撰寫、經費支持；段達榮、廖南生：數據整理、統計學分析；陳文曉：研究指導、論文修改