eNOS/NO 通路與冠脈介入治療術后再狹窄的相關性研究

黃杰，趙俊球，鄒奇霖，丁路遙

冠心病的早期篩查和急性冠脈事件的風險預警對冠心病的早期治療、延緩冠心病的發展進程和降低死亡率具有深遠的意義。經皮冠狀動脈介入治療術（簡稱冠脈介入術）是目前臨床最常用的治療冠心病的重建血運方法之一，可較大程度地提高患者的生存率[1]。內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是一氧化氮（NO）生物合成中的主要限速酶[2]。血管和心臟的正常生理功能維持與心肌和血管內皮中eNOS 的充分表達密切相關。研究報道，eNOS促進生成的NO可顯著加速缺血再灌注后動脈內皮狀態和功能的恢復，促進缺血部位的微循環形成和改善缺血后心功能[3]。急性心肌梗死發生時，患者血清eNOS 的含量會顯著下調[4]。冠脈支架內再狹窄的主要病理生理機制為內皮過度增生和新生粥樣斑塊形成。以往研究表明，eNOS 過表達可抑制頸動脈內皮損傷大鼠模型內膜增生[5]。另外，激活eNOS 表達可減少動脈粥樣硬化小鼠動脈硬化斑塊的生成。故eNOS 可能是治療冠脈支架內再狹窄的重要靶點[6]。本研究通過檢測急性冠脈綜合征患者冠脈介入術后血清eNOS 和NO 水平，探討eNOS/NO通路與術后再狹窄的相關性，為冠脈綜合征患者冠脈支架術后再狹窄提供新的預警指標，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性選取2019 年4 月至2022 年4 月麗水市中心醫院心內科收治的158 例行冠脈介入術的急性冠脈綜合征患者為研究對象，其中男102例，女56 例；年齡34 ～78 歲，平均（52.3±11.6）歲。本研究獲得麗水市中心醫院倫理委員會科研倫理小組批準，所有研究對象均同意參加本研究并簽署書面知情同意書。

納入標準：（1）臨床影像學、一般資料完整；（2）首次接受冠脈介入術；（3）經冠狀動脈造影驗證符合急性冠脈綜合征的臨床診斷標準[7]。排除標準：（1）心功能不全、ST 段抬高型、心臟瓣膜病、左束支傳導阻滯者；（2）近期有重大型手術史者；（3）凝血功能障礙者；（4）腫瘤患者，預期生存期不足半年。

1.2 術后再狹窄評定 所有患者冠脈介入術后隨訪1 年，截止時間為2023 年4 月。術后患者自行或因胸悶、心悸心慌、心絞痛等癥狀入院復查，并接受冠狀動脈造影。再狹窄判斷標準為支架兩端或支架內血管管腔狹窄度＞50%，根據是否發生再狹窄將患者分為未狹窄組（132 例）和再狹窄組（26 例）。冠脈血管狹窄程度在30%～50%、＞50%～70%、70%以上分別為輕度狹窄、中度狹窄和重度狹窄，輕度狹窄診斷為動脈粥樣硬化，中度狹窄診斷為冠心病。

1.3 觀察指標（1）一般資料：通過查閱患者病歷收集，包括性別，年齡，病程，冠脈狹窄程度，體質量指數（body mass index，BMI），冠脈病變血管（左前降支/冠脈左回旋支/右冠脈），高血壓，高血脂，病變直徑、長度，飲酒史，吸煙史和阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀鈣片停用時間等。（2）血清eNOS 和NO 水平檢測：采集患者冠脈介入術24 h 后靜脈血于抗凝管中，收集上層血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清eNOS 表達水平。選取26 例未狹窄組和26 例狹窄組患者冠脈介入術24 h 后外周血樣本，裂解紅細胞后，收集外周血細胞。外周血細胞eNOS 蛋白表達水平采用Western blot進行檢測，實驗中使用的Rabbit polyclonal anti-eNOS 購于Proteintech（中國武漢），并采用qPCR 檢測外周血細胞eNOS mRNA 表達水平。血清NO 采用亞硝酸鹽比色法進行檢測，嚴格參照試劑盒操作說明進行實驗，試劑盒購于上海碧云天生物技術股份有限公司。實驗中使用的引物序列eNOS-forward：5’-TGGGGCTGGGGCTGG-3’和reverse：5’-GGCGCAGCAGGATGG-3’；GAPDHforward：5’-CATGGTTTACATGT-3’和reverse：5’-AGCCAAAAGGGTCATC-3’。（3）炎癥因子檢測：采用酶聯免疫吸附法檢測患者冠脈介入術24 h后靜脈血血清白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血清腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor ，TNF）和IL-1（interleukin-1 ，IL-1）的表達水平，試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.4 統計方法 采用Excel 和Prism 9.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t 檢驗；計數資料以百分率表示，采用2檢驗。采用R 語言中cor 函數進行相關性分析。預測價值分析采用受試者工作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲線，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z 檢驗。影響因素分析采用Logistic 回歸分析。采用Image J 22.0 軟件對western blot 結果進行定量。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 隨訪期間，術后再狹窄率為16.46%。再狹窄組責任冠脈狹窄程度大于未狹窄組，高血壓患病比例高于未狹窄組，阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀鈣片停用時間長于未狹窄組（均P＜0.05）；其他指標差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清炎癥因子表達水平比較 再狹窄組血清IL-1、TNF-、IL-6 表達水平均高于未狹窄組（均P ＜0.05），見表2。

表2 兩組血清炎癥因子水平比較 ng/L

2.3 兩組血清eNOS、NO表達水平比較 再狹窄組血清eNOS、NO水平均低于未狹窄組（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清eNOS、NO 表達比較

2.4 兩組外周血細胞eNOS 蛋白和mRNA 表達水平比較 再狹窄組外周血細胞eNOS mRNA和蛋白表達水平均低于未狹窄組（均P ＜0.05），見圖1。

圖1 兩組患者外周血細胞eNOS 蛋白和mRNA 表達水平比較

2.5 血清eNOS、NO水平與炎癥因子和冠脈狹窄程度的相關性 患者血清eNOS、NO 水平與冠脈狹窄程度和血清TNF- 表達水平呈負相關（r=-0.861、-0.789、-0.901、-0.824，均P ＜0.05），與血清IL-6 和IL-1 水平無顯著相關性（均P＞0.05），血清eNOS 與NO 水平呈正相關（r=0.806，P ＜0.05）。

2.6 血清eNOS、NO表達水平對再狹窄的預測價值

eNOS、NO 及二者聯合預測介入術后再狹窄的AUC 分別為0.822（95%CI：0.705 ～0.938）、0.776（95%CI：0.639 ～0.913）、0.941（95%CI：0.901 ～0.982），NO 的AUC 小于二者聯合（Z=2.317，P ＜0.05），特異度分別為80.00%、70.05%、95.31%，敏感度分別為77.23%、86.23%、84.43%，eNOS、NO 的預測截斷值分別為17.56 pg/ml、46.63mol/L，見圖2。

2.7 影響冠脈介入術后再狹窄的Logistic分析 將再狹窄作為因變量，以eNOS、NO、IL-1、TNF-、IL-6、高血壓、停用阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀鈣片時間和冠脈狹窄程度為自變量進行多因素Logi stic 回歸分析，結果顯示，停用阿司匹林時間、停用阿托伐他汀鈣片時間、停用氯吡格雷時間、高血壓和血清eNOS、NO 為冠脈介入術后再狹窄的獨立風險因素（均P ＜0.05），見表4。

表4 影響冠脈介入治療術后再狹窄的Logistic 回歸分析

3 討論

冠脈介入治療已成為急性冠脈綜合征患者的常用治療手段，故與冠心病介入治療相關的臨床研究較多[8]。長期以來，支架內再狹窄是冠心病介入術后的嚴重并發癥之一和冠心病患者介入治療后的重點預防點。本研究對158 例急性冠脈綜合征患者入術再狹窄發生率為16.46%，提示冠脈綜合征患者冠脈介入術后有較高的再狹窄發生風險，故尋找介入治療術后再狹窄發生的風險預警指標十分必要。另外，本研究結果顯示，再狹窄組高血壓患者占比多于未狹窄組，阿司匹林、氯吡格雷、阿托伐他汀鈣片停用時間長于未狹窄組，這提示按醫囑定時服用藥物、穩定控制血壓對于冠脈綜合征患者預防介入術后再狹窄至關重要。

NO是內皮細胞產生的內源性的血管舒張因子，其在體內作用機制十分復雜，能夠抑制白細胞黏附、血管內皮細胞增生和平滑肌遷移、血小板聚集[9]。eNOS 是催化活性氧和L-精氨酸產生NO所必需的，eNOS 所催化產生的NO 是心肌局部組織中NO 的主要來源，能夠舒張血管，對心肌及血管內皮的保護作用十分明確[7]。eNOS 通過其內皮和心肌保護作用抑制心肌梗死的發生和發展過程，當eNOS 表達嚴重不足時，機體內源性NO 的生成急劇減少，患者發生心肌梗死的風險升高[10]。eNOS 活性及產量下降影響內皮細胞NO 的合成可能與患者冠狀動脈痙攣的發生有關[11]。本研究結果發現再狹窄組血清IL-6、TNF- 、IL-1水平高于未狹窄組（均P ＜0.05），而eNOS 和NO 水平低于未狹窄組（均P ＜0.05）；患者血清eNOS 與NO 含量呈正相關，eNOS 和NO 含量與血清TNF水平、冠脈狹窄程度呈負相。這提示冠心病患者介入治療術后再狹窄發生與血清eNOS、NO 水平密切相關。血清eNOS、NO 水平下調可能誘發內皮細胞釋放炎癥因子，進一步加劇患者的狹窄程度。多因素Logistic 回歸分析揭示eNOS、NO是再狹窄的獨立風險因子（均P ＜0.05）。ROC 曲線表明eNOS、NO不僅影響血管再狹窄的病理發生，還可對介入術后再狹窄進行早期預警。當eNOS、NO 小于二者預測截斷值17.56 pg/ml、46.63mol/L時，提示血管再狹窄的發生風險升高。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突