老年住院患者艱難梭菌定植情況、流行病學(xué)特征及定植危險(xiǎn)因素分析

杜恒超

艱難梭菌是梭菌屬中的一種專(zhuān)性厭氧、有芽孢、產(chǎn)毒素的革蘭陽(yáng)性粗大桿菌，生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較高，分離培養(yǎng)困難，多棲生在腸道內(nèi)，可通過(guò)糞口途徑引發(fā)外源性感染，還可在使用大量抗菌藥物后由腸道艱難梭菌引發(fā)內(nèi)源性感染[1-2]。研究顯示[3]，約25%的抗生素相關(guān)性腹瀉、75%的抗生素相關(guān)性腸炎及近100%的假膜性腸炎由艱難梭菌引起。本研究擬分析老年住院患者艱難梭菌定植情況、流行病學(xué)特征及定植危險(xiǎn)因素，以期為艱難梭菌感染的防控提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2022 年1—12 月浙江省榮軍醫(yī)院收治入院的老年住院患者300例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥65 歲；（2）病例資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)糞便或不接受糞便檢測(cè)者。其中男197 例，女103 例；年齡66 ～97 歲，平均（86.2±9.6）歲。本研究獲得浙江省榮軍醫(yī)院人體研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均同意參加本研究并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌的采集與鑒定 患者入院后均采集其糞便標(biāo)本，每份糞便樣本≥3 mg，將糞便樣本按照每份1 mg 分裝，取1 mg 糞便標(biāo)本置于離心管內(nèi)，并向離心管內(nèi)注入等體積的無(wú)水乙醇，充分震蕩后，靜置30 min，3 500 r/min，離心15 min，棄去上清液，將沉淀物接種于艱難梭菌鑒定（identification of clostridium difficile，CDIF）選擇性培養(yǎng)基上，35 ℃溫箱厭氧孵育48 h，根據(jù)艱難梭菌的扁平狀菌落、鏡下革蘭染色細(xì)菌形態(tài)及芽孢位置、馬廄性氣味等特征挑選可疑菌落，使用梅里埃VITEK MS IND MALDI TOF質(zhì)譜系統(tǒng)（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）進(jìn)行鑒定，鑒定為艱難梭菌陽(yáng)性的菌株接種于平板上，37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，并進(jìn)行純化、分離，保存艱難梭菌菌株[4]。

1.2.2 DNA的提取 將培養(yǎng)1 ～2 d的艱難梭菌菌落置于無(wú)菌0.9%氯化鈉注射液中制成0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，?0 000 r/min，離心1 min，棄去上清液，并加入180l 的裂解液，混勻，加入200 mg/ml 的溶菌酶20l，將濃度調(diào)整至20 mg/ml，37℃下孵育30 min，轉(zhuǎn)至賽默飛世爾核酸自動(dòng)提取儀提取核酸，所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[5]。

1.2.3 艱難梭菌毒素檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計(jì)毒素A、B 的基因引物，見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：體積為25l，含12.5l 的2×Tap Master Mix1，10 pmol 引物；反應(yīng)程序：94 ℃熱啟動(dòng)5 min、94 ℃變性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共循環(huán)30 次后，72 ℃再延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，時(shí)間20 ～30 min，使用培清JS-680D 全自動(dòng)凝膠成像分析儀分析。

表1 艱難梭菌毒素檢測(cè)所用引物

1.2.4 多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST） 參考文獻(xiàn)[8]選取7 對(duì)看家基因引物（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA 及tpi）測(cè)序，引物序列見(jiàn)表2。反應(yīng)體系：25l 的2×pfu Master Mix，上、下游引物（10 pmol/L）及DNA 模板各2l，19l 的ddH2O；反應(yīng)程序：94 ℃15 min、94 ℃30 s、50 ℃40 s、72 ℃70 s、共循環(huán)35 次后，72 ℃再延伸5 min；擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI3730xl 全自動(dòng)測(cè)序儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序峰圖使用Cromas 軟件進(jìn)行分析。將每一份樣品測(cè)定的7 家基因序列提交到公用數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubmlst.Org/Clostridium difficile）中比對(duì)，獲得相應(yīng)的等位基因譜和ST 型。

表2 MLST 引物

1.2.5 信息采集 收集患者病例資料，包括年齡、性別、發(fā)熱情況、基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕骸⑻悄虿?、高血脂及免疫功能低下）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清蛋白、血清肌酐、外科手術(shù)史、ICU收治、住院時(shí)間、自理能力、失能時(shí)間、抗生素暴露、使用化療藥物、惡性腫瘤及肝硬化情況。

1.3 觀察指標(biāo)（1）統(tǒng)計(jì)艱難梭菌定植率。（2）艱難梭菌毒素基因檢測(cè)。（3）產(chǎn)毒艱難梭菌的MLST 分型。（4）單因素分析老年住院患者艱難梭菌定植的危險(xiǎn)因素。（5）多因素Logistic 回歸分析老年住院患者艱難梭菌定植的危險(xiǎn)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析危險(xiǎn)因素。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌定植率 300 例患者糞便標(biāo)本中，95例患者發(fā)現(xiàn)艱難梭菌定植，定植率31.67%。

2.2 艱難梭菌毒素基因檢測(cè) 95 株艱難梭菌菌株中，非產(chǎn)毒艱難梭菌（毒素基因?yàn)閠cdA-/tcdB-）16 株（16.84%），產(chǎn)毒艱難梭菌79 株（83.16%），產(chǎn)毒艱難梭菌中毒素基因?yàn)閠cdA+/tcdB+者51 株（64.56%），毒素基因?yàn)閠cdA-/tcdB+者28 株（35.44%）。

2.3 產(chǎn)毒艱難梭菌的MLST 分型 79 株產(chǎn)毒艱難梭菌基因組DNA 測(cè)序所得數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較得出等位基因，共分析出12 個(gè)ST 型，其中ST39 型最為常見(jiàn)，共17 株（21.52%）；其次為ST54 型14 株（17.72%），剩余其他各型分別為ST3型8株（10.12%），ST81 型8 株（10.12%），ST35 型7 株（8.86%），ST99 型7 株（8.86%），ST5 型6 株（7.59%），ST42 型5 株（6.33%），ST2 型3 株（3.80%），ST278 型2 株（2.53%），ST102 型1 株（1.27%），ST294 型1 株（1.27%）。

2.4 危險(xiǎn)因素的單因素分析 患者年齡較大、免疫功能低下、住院時(shí)間長(zhǎng)及抗生素暴露均為老年住院患者艱難梭菌定植的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 老年住院患者艱難梭菌定植危險(xiǎn)因素單因素分析

2.5 危險(xiǎn)因素的多因素分析 經(jīng)Logistic 分析顯示，年齡較大、免疫功能低下、住院時(shí)間長(zhǎng)及抗生素暴露是老年住院患者艱難梭菌定植的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P ＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 Logistic 回歸分析老年住院患者艱難梭菌定植的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

3 討論

近年來(lái)，由于抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致艱難梭菌等致病菌的耐藥性日益增強(qiáng)，高毒力艱難梭菌菌株NAP1/027/BI的出現(xiàn)，致使艱難梭菌感染暴發(fā)，并在世界范圍的流行，其高致病率及高死亡率引起廣泛關(guān)注[9-10]。研究老年人群中艱難梭桿菌感染的分子學(xué)流行病學(xué)特征及危險(xiǎn)因素，對(duì)艱難梭桿菌感染的臨床防治具有重要意義。

本研究中，300 例糞便標(biāo)本中，95 例患者發(fā)現(xiàn)艱難梭菌定植，定植率為31.67%，高于錢(qián)嬌等[11]研究中28.6%的感染率，這可能與本研究對(duì)象為老年長(zhǎng)期住院患者有關(guān)。本研究對(duì)艱難梭菌菌株進(jìn)行毒素基因鑒定及MLST 分型結(jié)果顯示，與祁琪等[12]研究中基本一致。但國(guó)外研究顯示[13]，產(chǎn)毒艱難梭菌常見(jiàn)ST型為ST42 型、ST17 型、ST378 型。國(guó)內(nèi)外研究中艱難梭菌常見(jiàn)ST型差距較大，說(shuō)明不同國(guó)家艱難梭菌主導(dǎo)菌株差異較大。

本研究分析老年住院患者艱難梭菌感染的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，年齡較大、免疫功能低下、住院時(shí)間長(zhǎng)及抗生素暴露是老年住院患者艱難梭菌定植的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。說(shuō)明年齡較大、免疫功能低下、住院時(shí)間長(zhǎng)及抗生素暴露的老年住院患者是感染艱難梭菌的高危人群。其原因可能為：（1）老年患者隨年齡增高，免疫衰退，機(jī)體免疫功能低下，難以抵抗細(xì)菌等致病微生物的入侵，機(jī)體難以及時(shí)清除衰老的死亡細(xì)胞，艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)較高。（2）長(zhǎng)期住院患者多伴有自身免疫功能異常，可增加艱難梭菌感染風(fēng)險(xiǎn)。虞美玲等[14]研究顯示，住院時(shí)間長(zhǎng)是艱難梭菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本研究基本一致。（3）抗生素暴露可對(duì)患者機(jī)體產(chǎn)生影響，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，篩選或誘導(dǎo)出耐藥菌株，艱難梭菌定植風(fēng)險(xiǎn)較高。

綜上所述，老年住院患者艱難梭菌定植率較高，定植菌株多為產(chǎn)毒艱難梭菌，其基因型以ST39 型最為常見(jiàn)，其次為ST54 型；而年齡較大、免疫功能低下、住院時(shí)間長(zhǎng)及抗生素暴露是老年住院患者艱難梭菌定植的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床針對(duì)此類(lèi)高危人群應(yīng)及時(shí)采取干預(yù)措施。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突