硫氰酸紅霉素降低雜質B精制工藝研究

＊郭佳 黃延智

（寧夏泰益欣生物科技股份有限公司 寧夏 750205）

紅霉素為紅色鏈霉菌培養分離而來，屬于大環內酯類抗生素的一種，具有廣譜的抗菌特性，尤其對革蘭氏陽性菌抗性更為敏感，如肺炎球菌、白喉桿菌、葡萄球菌、化膿性鏈球菌及炭疽桿菌等引起的感染[1]。紅霉素為脂溶性物質，易溶于有機溶劑，極難溶于水、味苦、口感不佳是其在臨床中的最大缺陷，硫氰酸紅霉素是紅霉素的硫氰酸鹽，這種鹽類增加了在水中的溶解性，又能保留紅霉素的抗菌活性，因此在臨床中得到了廣泛的應用。硫氰酸紅霉素在臨床中抗菌機理為：通過皮下注射或口服進入機體后，硫氰酸紅霉素中硫氰酸基團被脫除，紅霉素能夠特異性與細菌核蛋白體50S 大亞基的P 位結合改變核蛋白體結構或使其失活，抑制細菌蛋白、核酸的合成從而達到抑菌的效果[2]。

紅霉素主要通過生物發酵法制備而來，其化學分子結構由14 元環的紅霉素內酯環、紅霉糖和脫氧氨基己糖通過糖苷鍵鏈接而成[3]。紅霉素A（ErA）為主要的活性產物，也是在抗菌過程中發揮主要作用的物質，紅霉素A 在偏堿性環境中活性較高，酸性條件下紅霉素A 活性降低甚至降解[4]。另外，生物發酵過程中也會產生一些紅霉素A 的異構體，分別為紅霉素B（ErB）、紅霉素C（ErC）、紅霉素D（ErD）、紅霉素E（ErE）和紅霉素F（ErF），這些物質與紅霉素A 結構特性相似，因此在提取過程中這幾種雜質的高低直接關系到成品純度。其中，紅霉素B 和紅霉素C 是紅霉素發酵過程中產生的兩種主要的雜質，其抗菌活性僅是紅霉素A 的15%～20%，且紅霉素B 和紅霉素C 的毒性較大，而紅霉素E 與紅霉素F 由于含量極少，國內外關于其分離純化及化學性質方面的報道較少[3]。關于它們的化學分子結構如圖1 和表1 所示。

表1 組分結構匯總

圖1 紅霉素結構

目前，紅霉素已經成為世界抗生素市場上的第三大類藥物，國內對生產紅霉素競爭激烈。但目前受發酵菌種與提取水平的限制，硫氰酸紅霉素的提取收率低于80%，且產品純度不高，影響了產品的性能[5]。傳統的工序為陶瓷膜過濾、樹脂脫色、納濾濃縮、水相結晶、粗品精制，其中粗品精制是可以提升產品質量的關鍵環節[6]。雜質B 在精制過程中，易與硫氰酸鈉反應結晶。本試驗將采取分段結晶的方式控制結晶參數，對粗品精制進行優化提升產品純度降低雜質含量。限于目前生產工序，如能降低產品雜質含量提升產品純度，就能產生一定的經濟效益。本研究立足于生產的實際情況，在不額外增加生產成本的情況下，實現產品效能增收。

1.試驗與儀器

試驗過程中所使用的儀器、試劑如圖表2、表3所示。

表2 儀器列表

表3 試劑列表

2.試驗方案

(1)不同pH分階段精制試驗

取一定質量的硫氰酸紅霉素粗品溶于丙酮溶液，用液堿調pH 至澄清狀態，然后用10%的氯化鈉溶液分兩次進行鹽洗，靜置一定時間將鹽洗液分離干凈。用冰醋酸調pH 至8.0 后加硫氰酸鈉，出晶后抽濾得一次晶體Ⅰ，將結晶母液分兩組進行試驗：①組將結晶母液pH 回調至7.0，再加入一定體積的純化水養晶一定時間，抽濾得二次晶體Ⅰ；②組將結晶母液pH 穩定在8.0，加一定體積純化水養晶一定時間，抽濾得二次晶體Ⅱ；③組再取一定質量的硫氰酸紅霉素粗品溶于丙酮溶液，用液堿調pH 至澄清狀態，然后用10%的氯化鈉溶液分兩次進行鹽洗，靜置一定時間將鹽洗液分離干凈。用冰醋酸調pH 至8.5 后加硫氰酸鈉得一次晶體Ⅲ，再將結晶母液回調pH 至7.0，加一定體積純化水后養晶一定時間，抽濾得二次晶體Ⅲ。

(2)不同起始pH析晶試驗

分別稱取兩份質量相等的硫氰酸紅霉素粗品溶于丙酮溶液，用液堿調pH 為9.0，然后用10% 的氯化鈉溶液分兩次進行鹽洗，靜置一定時間將鹽洗液分離干凈。

試驗一：溶液Ⅰ中加入硫氰酸鈉溶液攪拌均勻，再滴加冰醋酸至晶體析出，離心過濾后得一次晶體Ⅰ和母液Ⅰ,將結晶母液Ⅰ調pH 至7.2，再加一定體積的純化水養晶一定時間后，過濾得二次晶體Ⅰ。

試驗二：溶液Ⅱ先調pH 至8.5，再加入硫氰酸鈉，繼續滴加冰醋酸至晶體析出，離心過濾，得一次晶體Ⅱ和母液Ⅱ，將結晶母液Ⅱ調pH 至7.2，再加一定體積的純化水養晶一定時間后，過濾得二次晶體Ⅱ。

3.結果分析

(1)不同pH分階段結晶對粗品精制組分的影響

取車間工藝中的粗品，按車間工藝對試驗進行等比例縮小，驗證調節pH 對粗品精制過程中組分的影響，結果如表4 和表5 所示。

表4 不同pH 分階段結晶工藝數據

表5 各階段總組分含量

由表4 可知，粗品精制過程中，一次晶體中的硫氰酸紅霉素A 較粗品明顯提升，雜質B 含量也明顯提升，分別上升0.23%、0.14%，這表明雜質B 在一次結晶過程中易與硫氰酸鈉反應形成晶體析出。由①、③兩組試驗可知，一次晶體Ⅲ中的A 組分含量較一次晶體Ⅰ高0.59%，一次晶體Ⅰ中雜質B 含量高于一次晶體Ⅲ。這表明，一次結晶過程中，將pH 控制在8.0 有利于雜質B 的去除。

由表4 和表5 中①、②兩組試驗可知，在二次結晶過程中，二次晶體Ⅰ和二次晶體Ⅱ中的總組分和雜質B 含量均無明顯差異性，相對于粗品，雜質B 分別降低0.36%和0.37%，A 組分含量分別上升13.26%和13.71%，這表明不同pH 分階段結晶可以有效去除精制液中雜質B 的含量，提升A 組分含量。二次晶體Ⅱ中A 組分含量較二次晶體Ⅰ高0.45%，這表明，在二次結晶過程中，將pH 控制在8.0 更有利于去除雜質B 提升A 組分含量。

(2)不同起始pH對晶體組分的影響

上述試驗已經驗證了不同pH 分階段結晶對粗品精制組分的影響，本節試驗主要驗證不同起始pH 對晶體組分的影響。取用車間工藝中的粗品，按車間工藝對試驗進行等比例縮小進行試驗，結果如表6 所示。

表6 不同起始pH 析晶工藝數據

由表6 可知，一次結晶過程中，一次晶體中的硫氰酸紅霉素A 組分較粗品均提升明顯，雜質B 含量也均明顯提高，分別升高0.19%和0.15%；二次結晶過程中，二次晶體Ⅰ中A 組分高于二次晶體Ⅱ，雜質B含量較二次晶體Ⅱ中的低，這表明在粗品精制試驗過程中，起始pH 為9.0 時更有利于去除雜質B 提升A 組分含量。

4.結論

（1）不同pH 分段結晶試驗中，通過對比試驗可知，一次結晶過程中，將pH 控制在8.0 有利于雜質B的去除，二次結晶過程中，將pH 控制在8.0 有利于去除雜質B 提升A 組分含量。

（2）采用不同起始pH 析晶的方式進行粗品精制試驗，實驗結果顯示，一次結晶過程中，一次晶體中的A 組分和雜質B 含量較粗品均提升明顯，二次結晶過程中，二次晶體Ⅰ中A 組分高于二次晶體Ⅱ，雜質B 含量較二次晶體Ⅱ中的低，說明起始pH 為9.0 時更有利于去除雜質B 提升A 組分含量。