蛋白核小球藻原位催化制備生物柴油的研究

＊劉歡 王一同 郭璇

（華北理工大學 河北 063210）

在工業化時代，不可再生化石燃料的枯竭和溫室氣體過度排放促使人們開始發掘第三代原料（微藻）生產生物柴油的潛力，微藻生物柴油因其碳中性、環境友好和可持續性備受關注[1-2]。蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）具有以下優勢：（1）生長條件簡單、生長速度快、光合效率高。（2）擁有高效固定二氧化碳和處理廢水的能力。（3）高生物量，富含高價值化合物（如脂質和碳水化合物）[3]。

傳統上，微藻生物質合成生物柴油包括兩個步驟，一是從微藻生物質中提取油；二是將微藻油催化酯交換為生物柴油。傳統的兩步法需要消耗更多能量，不具有良好的經濟價值，而“一步”原位酯交換法可以解決這個問題。原位酯交換法是指使用含油原料提取油并催化轉化為生物柴油的一步過程，即提油和催化酯交換同時進行[4-5]。原位酯交換過程中催化劑的加入大大加快了反應速率，用于生產生物柴油的優選催化劑是均相催化劑，因為它們使用簡單并且完成反應所需時間短。均相催化劑中最常用的就是H2SO4，因為它的價格低，可以在低溫和低壓下進行，與其他無機酸（H3PO4、HCl 和有機磺酸）相比，H2SO4的特征在于較高水平的活性[6]。H2SO4催化的酯交換反應需要大量的醇（如甲醇）以獲得高產率的生物柴油。在原位酯交換法中，甲醇具有雙重功能，分別作為脂質提取的化學溶劑和反應物，從而減少化學溶劑的投入，該技術消除了昂貴繁瑣的細胞破壞和干燥步驟，最大限度地減少了脂質提取和溶劑回收步驟，大大降低了該過程的能耗，減少了初始投資和間接成本[7-8]。Juliana S.Lem?es 等人[9]分別使用原位酯交換法和萃取-酯交換法（先萃取后酯交換）生產脂肪酸乙酯。結果表明，原位酯交換法產生的生物柴油質量更高，且原位酯交換是一種更有效、更環保、更綠色的方法。生物柴油的質量與不含雙鍵的飽和脂肪酸占比密切相關。生產生物柴油的首選脂肪酸是具有中等長度碳鏈的C16 家族（如棕櫚酸）和C18 家族（包括油酸、亞油酸和硬脂酸），這些脂肪酸能抵抗生物柴油的降解和自氧化，從而產生更多的十六烷，這是決定生物柴油燃燒質量和噴射到點火延遲時間的關鍵設置。高百分比的飽和脂肪酸是獲得高質量生物柴油的理想選擇[10-11]。

本研究使用的是培養收獲冷凍干燥后的干蛋白核小球藻藻粉，通過原位酯交換催化微藻細胞中的脂質轉化為高附加值的生物柴油；通過對微藻生物柴油產率和組分分析，探討蛋白核小球藻原位酯交換生產生物柴油的能力。

1.試驗部分

(1)試驗試劑

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），BG11 培養基，上海光語生物科技有限公司；甲醇（CH3OH，≥99.5%）、硫酸（H2SO4，95.0%～98.0%）、石油醚（AR）、十七酸甲酯（C17:0，≥99%）、棕櫚酸甲酯（C16:0，≥99.0%）、油酸甲酯（C18:1，≥99.0%）、硬脂酸甲酯（C18:0，≥99.5%）、棕櫚油酸甲酯（C16:1，＞99%），上海阿拉丁生化技術有限公司；亞麻酸甲酯（C18:3，＞99.5%）、亞油酸甲酯（C18:2，＞99%），上海麥克林生化科技有限公司；十七烯酸甲酯（C17:1，＞99%），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；二氯甲烷（CH2Cl2），天津津東天正精細化學試劑廠。

(2)試驗儀器

艾柯超純水機（Exceed-Ad-32），成都艾柯水處理設備有限公司；電子分析天平（FA-2004）、循環水真空泵（SHZ-D）、超凈工作臺（SW-CJ-1D）、油浴鍋（DF-101S）、高溫蒸汽滅菌鍋（DGL-50B），上海力辰邦西儀器科技有限公司；pH 計（PHS-3E），上海儀電科學儀器股份有限公司；光照培養箱（GXZ-500B），寧波江南儀器廠；高速離心機（H3-18K），湖南可成儀器設備有限公司；冷凍干燥機（SCIENTZ-10N），寧波新芝生物科技股份有限公司；氣相色譜儀（GC-2014C），島津（上海）實驗器材有限公司。

(3)蛋白核小球藻培養

用電子分析天平稱取一定質量的BG11 固體培養基溶解于蒸餾水中，配置BG11 培養基，在高溫蒸汽滅菌鍋中于121 ℃下滅菌20 min，隨后冷卻至25 ℃，用0.45μm 有機過濾膜抽濾掉雜質后備用。將經過多次擴培后高活性的蛋白核小球藻（50 mL）接種于BG11 培養基中，接種操作在超凈工作臺中完成。將接種后的培養基（1000 mL）轉移到光照培養箱中，培養條件設置為：培養溫度25 ℃，光照強度4000 Lux 和晝夜比12/12。培養結束后，將藻液用高速離心機（8000 r/min，10 min）離心，移除上清液，沉淀物轉移至冷凍干燥機在-50 ℃下干燥蛋白核小球藻得到藻粉。

(4)微藻原位催化制備生物柴油

稱取蛋白核小球藻粉末（1 g）、甲醇（19 mL）、H2SO4（1 mL），三者放入50 mL 玻璃瓶中，將油浴鍋溫度設置為90 ℃，磁力攪拌2 h。反應結束后，產物分為兩相，上相為混合液產物（粗生物柴油），下相為藻渣。取上相粗生物柴油，用去離子水洗滌去除H2SO4，直至洗到pH 值為7.00。將石油醚（10 mL）加入洗滌后的粗生物柴油中，形成混合液產物，離心后分為兩相，上相為生物柴油和石油醚的混合物，下相為甘油。取上相，用0.22μm 有機過濾膜過濾混合的生物柴油和石油醚，將加熱板溫度設置為75 ℃，加熱至恒重，用氣相色譜儀定性定量分析。

在酸催化的甲酯化制生物柴油的過程中，同時發生著游離脂肪酸的酯化反應和甘油酯與甲醇之間的酯交換反應。酯交換反應過程比較復雜，油脂中的3 個脂肪酸依次與甲醇反應，生成脂肪酸甲酯（FAME），甘油三酯依次變為甘油二酯和甘油酯，最后轉化為甘油[12]。反應總方程式如圖1。

圖1 酯交換反應過程原理圖

使用氣相色譜儀，將參數設置為進樣溫度250 ℃，色譜柱初溫140 ℃，保持5 min 恒定后，以2 ℃/min 升溫至230 ℃，保持20 min，檢測器溫度260 ℃，載氣流速1 mL/min，分流比為10:1，分析預處理后的微藻生物柴油（脂肪酸甲酯，FAME）。以二氯甲烷作為溶劑，十七烷酸甲酯（HAME，C17:0）為內標物，對生物柴油樣品進行定量分析，根據標準甲基物的權重、標定因子和峰面積，計算生物柴油產率。

式中：

Y—生物柴油產率，%；

WHAME—HAME 的質量，g；

AFAME—FAME 的色譜峰峰面積，uV·min；

AHAME—HAME 的色譜峰峰面積，uV·min；

Fi—校正因子；

WC—粗生物柴油的質量，g。

棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和十七烯酸甲酯對十七酸甲酯的校正因子分別為1.563、0.977、0.952、1.025、0.564、1.345 和1.027。每種脂肪酸甲酯按氣相色譜外標法測定。

2.結果與討論

蛋白核小球藻原位催化生物柴油。干燥后的蛋白核小球藻在90 ℃下用H2SO4催化2 h 進行原位酯交換，獲得了76.86%的高生物柴油產率，通過氣相色譜分析結果，主要發現了7 種不同的脂肪酸。表1 給出了生物柴油中脂肪酸的組成和濃度，主要脂肪酸甲酯為C16:0、C16:1、C17:1、C18.0、C18:1、C18:2 和C18:3，其中，C18:2 的含量比例超過38.12%。C16 家族脂肪酸甲酯含量占比超過22.05%，C18 家族脂肪酸甲酯含量占比超過66.59%。高濃度的C16 和C18 家族脂肪酸甲酯是生物柴油的理想原料，高飽和脂肪酸含量被認為有利于生物柴油的冷流動性能和氧化穩定性[13-14]，這表明蛋白核小球藻原位酯交換生產出了高質量的生物柴油。

表1 蛋白核小球藻原位酯交換生產的生物柴油（脂肪酸甲酯）組分占比

3.結論

原位酯交換法被認為是從微藻商業化生產生物柴油的重大改進。在傳統的兩步酯交換工藝中，脂質提取和酯交換分為兩步來生產生物柴油，由于傳統酯交換工藝的繁瑣復雜，近些年“一步”原位酯交換更受到研究者的喜愛。生物柴油的質量取決于存在的長鏈脂肪酸的性質，C16 和C18 脂肪酸的存在表明了高質量生物柴油的可能性。本研究利用培養的蛋白核小球藻直接進行原位酯交換生產生物柴油，對其生物柴油產率及其組分占比進行分析。結果表明，培養蛋白核小球藻原位酯交換生物柴油產率高達76.86%，過程中還產生了C16（22.05%）和C18（66.59%）的高價值生物柴油組分。