中草藥山茱萸中花色苷的提取方法研究

＊張珊 邢昭曄 焦曉燕

（河北北方學院 河北 066000）

我國中醫傳統歷史悠久，目前中草藥的應用日益廣泛。為了更好的發揮中草藥的藥用、經濟價值，并在化學實驗教學中滲透中草藥提純與分析方法，中草藥成分的提純與分析方法研究已經成為一項重要課題。在眾多中草藥成分提純技術中，膜分離技術[1]、高效液相色譜分析技術[2]、光纖紅外光譜[3]等已經被廣泛應用。

山茱萸含有多糖、環烯醚萜類、苷類等[4]物質，其提取方法有溶劑萃取法[5-6]、水提法[7]和超臨界流體法[8]，相比而言，溶劑萃取法具有簡捷高效、操作簡單的特點[9]。花色苷提純方法主要有色譜法、大孔樹脂純化法等，大孔樹脂法由于其價廉、簡捷的特點而被應用于中草藥成分純化中[10]。測定花色苷含量常用的方法有色價法[11]、pH 示差法[12]以及高效液相色譜法[13]，其中應用最廣泛的是pH 示差法[14]，該方法具有較高的準確度、靈敏度較高等優點[15]。

1.試驗部分

（1）試驗試劑。三氟乙酸（分析純、天津市津東天正精細化學試劑廠）、甲醇（分析純、天津市化學試劑三廠）、氯化鉀（分析純、天津市化學試劑三廠）、醋酸鈉（分析純、天津市化學試劑三廠）、醋酸（分析純、天津市津東天正精細化學試劑廠）、鹽酸（分析純、天津市津東天正精細化學試劑廠）、氫氧化鈉溶液（分析純、天津市化學試劑三廠）、山茱萸（麗天承 北京同仁堂）、D101、AB-8、HPD700、HPD100 樹脂。

（2）試驗儀器。U-3900 紫外分光光度計、721 可見分光光度計、旋蒸儀（上海亞榮生化儀器廠）、粉碎機（RS-FS1401 榮事達）、空氣浴恒溫搖床（THZ-82 金壇區金城春蘭實驗儀器廠）、HH 系列數顯水浴鍋（金壇市科析有限公司）、磁力攪拌器（金壇區白塔新寶儀器廠）、GD 系列無線pH 傳感器。

（3）預實驗。本實驗采用三氟乙酸甲醇溶液提取山茱萸花色苷，將山茱萸粉碎，稱取5.0 g 于200 mL錐形瓶中，加入100 mL 3% TFA，在30 ℃的恒溫水浴鍋中浸提0.5 h，取粗提取液50 mL，選用AB-8 樹脂進行純化。然后用旋蒸儀減壓濃縮除去三氟乙酸甲醇溶液，最后用去離子水稀釋到100 mL，測定其在可見光區的最大吸收波長λ 及在此波長下的吸光度A。

（4）探究溶劑萃取法的提取條件。在預實驗的基礎上，依次探究提取溫度、提取時間、提取劑濃度、提取劑pH 和物料比等提取條件對山茱萸花色苷提取的影響。

稱取山茱萸2.0 g 于100 mL 錐形瓶中，加入25 mL 3% TFA，用鹽酸將pH 值調至2，置于恒溫水浴鍋中，浸提1 h，溫度為20 ℃。用可見分光光度計測提取液A510nm。首先，稱取山茱萸2.0 g 于100 mL 錐形瓶中，溫度變量設為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；第二次調整時間變量，設為1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h；第三次調整三氟乙酸甲醇的濃度變量，設為1%、2%、3%、4%、5%；第四次調整pH 值變量，設為1、2、3、4；最后調整物料比（m/v）變量設為2 g:20 mL、2 g:30 mL、2 g:40 mL、2 g:50 mL，分別用可見分光光度計測提取液A510nm。

（5）對花色苷粗提取液進行純化。本實驗選取D101、AB-8、HPD700、HPD100 樹脂對山茱萸花色苷進行純化。通過實驗選擇效率最高的，為下面實驗測定山茱萸花色苷含量做準備。

①對大孔樹脂進行預處理。稱取D101 大孔樹脂5.0 g，在3%三氟乙酸甲醇中浸泡24 h，用蒸餾水洗滌，再用3%三氟乙酸甲醇淋洗，其余樹脂的預處理實驗步驟同上。

②篩選純化效果最佳的大孔樹脂。稱取1.0 g 樹脂，加入10 mL 粗提取液，在空氣浴恒溫搖床中吸附24 h，用可見分光光度計測定上清液吸光度，吸附率和解吸率分別按下式計算。

式中：A0—初始吸光度；A—吸附后吸光度；E—吸附率[16]。

稱取0.2 g 樹脂，再加入10 mL 3%三氟乙酸甲醇溶液，在110 r/min 的空氣浴恒溫搖床中，溫度控制在25 ℃，解吸12 h。

式中：D—解吸率；A1—解吸后吸光度。

（6）運用pH 示差法測定山茱萸花色苷的含量[17]。分別將取純化后的提取液中加入到pH 為1.0 和pH 為4.5 緩沖液中，分別測定A510nm和A700nm。花色苷含量按下式計算。

式中：C—花色苷質量濃度（mg/L）；A—花色苷總吸光度；DF—稀釋倍數；M—花色苷分子量；V—提取液的總體積（mL）；m—稱取的山茱萸質量（g）；E—花色苷摩爾消光系數[18]。

矢車菊素-3-O-β-吡喃型半乳糖苷：M-449.2（mg/mol）、E-26900（mol-1）。

2.結果與分析

(1)對山茱萸花色苷紫外吸收光譜進行結果分析

山茱萸，紅色至紫紅色,富含花色苷類物質。由圖1 可知，提取液的最大吸收波長為510 nm，最大吸光度為0.011。花色苷在可見光區的特征吸收峰在500～530 nm 之間，說明510 nm 為山茱萸提花色苷提取的測定波長。

圖1 山茱萸花色苷紫外可見吸收光譜圖

(2)用單因素試驗探究溶劑萃取法提取山茱萸的條件

由圖2～圖6 可知，山茱萸花色苷的最佳提取條件為：3%三氟乙酸甲醇溶液，物料比2 g:30 mL，pH為2，60 ℃水浴3 h。

圖2 提取溫度對山茱萸花色苷提取的影響

圖3 提取時間對山茱萸花色苷提取的影響

圖4 提取劑濃度對山茱萸花色苷提取的影響

圖5 提取劑pH 對山茱萸花色苷提取的影響

圖6 物料比對山茱萸花色苷提取的影響

(3)對大孔樹脂的吸附率和解析率進行結果分析

由表1 可知，吸附率和解吸率最高的是AB-8 大孔樹脂，其純化效果最好。AB-8 大孔吸附樹脂具有高效、高選擇性、高穩定性和易操作等優點。所以在后續測定山茱萸花色苷的定量分析的實驗中選擇AB-8 大孔樹脂進行純化。

表1 大孔樹脂的吸附率和解吸率

(4)pH示差法測定山茱萸花色苷含量的結果分析

當pH 為1 時，提取液A510nm為0.485，A700nm為0.225；當pH 為4.5 時，提取液A510nm為0.281，A700nm為0.143。經式（1）～（3）和式（1）～（4）計算得花色苷的濃度為0.041 mg/g。

3.結論與啟示

本研究以中草藥山茱萸為原料提取花色苷，創新性的選擇三氟乙酸甲醇溶劑萃取法，采用單因素試驗探究提取條件對三氟乙酸甲醇溶劑萃取花色苷的影響。經過三氟乙酸甲醇溶劑萃取法得到山茱萸花色苷的粗提取液，選擇大孔樹脂純化粗提取液，根據結果分析可知AB-8 樹脂純化效果最好。選取pH 示差法對純化后花色苷濃度進行測定，根據公式得出山茱萸花色苷的濃度為0.041 mg/g。我國的中醫傳統歷史悠久，中醫藥學經歷了五千年的繼承與弘揚。

本研究為天然花色苷在食品工業、醫藥、化妝品等領域的應用提供了方法，為山茱萸資源的高值化利用提供了科學試驗依據。