不同標本類型在非小細胞肺癌基因檢測中的應用及意義*

朱啟淦 孟加榕 魁國菊 張小紅 黃江賓 禹樂

(聯勤保障部隊第九〇九醫院·廈門大學附屬東南醫院病理科,福建 漳州 363000 )

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,全世界每年因肺癌死亡人數約160萬人[1-2]。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的75%～85%,初診并發現轉移的患者5年生存期約為5%,生存率較低[3-4]。隨著基因檢測技術及分子病理學的發展,NSCLC驅動基因異常被相繼發現,肺癌的診斷從組織學分型轉向分子分型,促使肺癌的診療進入到個體化分子靶向藥物治療時代[5]。明確驅動基因狀態是分子靶向藥物治療的基礎,中國NSCLC診療指南[6]推薦,在NSCLC患者治療前需檢測表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因,條件允許時可同時進行EGFR、間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)、C-ros原癌基因1-受體酪氨酸激酶(C-ros oncogene 1-receptor tyrosine kinase,ROS1)等多基因聯合檢測,以協助臨床診療。因我國肺癌一經發現大多處于晚期或伴有轉移而無法手術切除,且標本的來源及質量常影響到基因檢測結果。本研究采用擴增阻滯突變系統(Amplification refractory mutation system,ARMS)法對180例不同標本類型NSCLC患者行驅動基因聯合檢測,分析不同標本類型基因突變的檢出率及驅動基因狀態與臨床病理參數的關系,分析驅動基因聯合檢測的意義,進而為NSCLC患者個體化靶向藥物治療提供取樣途徑參考及分子病理學依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2021年1月—2021年12月聯勤保障部隊第九〇九醫院病理科明確診斷為NSCLC患者,并有足夠的腫瘤細胞進行后續驅動基因聯合檢測的樣本180例。其中女性56例,男性124例;年齡33～87歲,中位年齡(57±5)歲;腺癌154例,非腺癌26例(包括鱗癌、腺鱗癌及未分化癌);手術切除標本25例,肺活檢標本80例(包括肺細針穿刺和支氣管鏡活檢),胸腔積液細胞蠟塊標本29例,轉移病灶標本46例(包括骨、淋巴結、肝、腦等轉移)。本研究通過醫院倫理委員會審核通過。

1.2 試劑與儀器 德國LEICA RM2245切片機,廈門愷碩HF24全自動核酸純化儀,石蠟包埋組織切片組織樣品基因組DNA/RNA一步式提取試劑盒均購于廈門凱碩生物科技有限公司,人類5種突變基因檢測試劑盒購于廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司,UPT-100超微量核酸蛋白測定儀,美國ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.3 FFPE DNA和RNA的提取 石蠟包埋組織按5～10 μm的厚度進行切片,取5～10片于1.5 mL離心管中(視標本組織量增減切片數量),每個組織樣本取2管,分別用于DNA和RNA提取。樣本DNA和RNA提取操作方法及步驟嚴格按FFPE組織樣品基因組DNA和RNA一步式提取試劑盒說明書進行。所提DNA和RNA需立即檢測,或-20 ℃保存。

1.4 FFPE DNA和RNA濃度測定 使用微型紫外分光光度計測定樣本RNA和DNA濃度,所提RNA濃度應介于10～500 ng/μL,DNA濃度應大于2 ng/μL,DNA和RNA的OD260/280應在1.8～2.1之間。樣本DNA上機濃度稀釋至1.5～3 ng/μL。

1.5 ARMS PCR檢測驅動基因突變 向體積均為45 μL的待檢樣品RNA、LMG陽性質控品、純化水中各加入5 μL LMG混合酶A;向體積均為42.3 μL的待檢樣品DNA、LMG陽性質控品、純化水中各加入2.7 μL LMG混合酶B;混勻后短暫離心,將混好的RNA樣品依次取10 μL加入LMG 12聯PCR反應條的①-④號管中,將混好的同一份DNA樣品依次取5 μL加入LMG 12聯PCR反應條的⑤-號管中,蓋上LMG 12聯PCR反應條管蓋,短暫離心,放入ABI7500實時PCR儀中。反應程序嚴格按照試劑盒說明書進行設置。

1.6 結果判斷 5種突變基因檢測試劑盒常見基因異常包括ALK基因融合、ROS1基因融合、BRAF 15號外顯子基因突變、KRAS 2號外顯子基因突變及EGFR 18、19、20及21號外顯子基因突變。基因突變結果的判讀嚴格按照試劑盒說明書陽性判斷值及檢驗結果的解釋進行。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件分析,基因突變率以(%)表示,臨床病理參數組間比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5種驅動基因突變在NSCLC中的分布 5種驅動基因的總突變率為53.33 %(96/180),未發現不同驅動基因之間的共存突變。EGFR基因突變率40.56%(73/180),包括19Del突變29例、L858R突變36例、L861Q突變2例、20-Ins突變1例、19Del和T790M雙突變2例、L858R和T790M雙突變2例、G719X和L861Q雙突變1例,在5種驅動基因中突變頻率最高。KRAS基因突變率6.11%(11/180),ALK融合基因突變率4.44%(8/180),ROS1融合基因突變率1.11%(2/180),BRAF基因突變率1.11%(2/180),見圖1、表1。

表1 EGFR、KRAS、BRAF基因突變與臨床病理特征的關系

圖1 NSCLC 標本驅動基因擴增曲線

2.2 NSCLC中EGFR、KRAS和BRAF基因突變與臨床病理特征關系 EGFR基因突變率在女性患者53.57%(30/56)及腺癌患者44.81%(69/154)中較高,性別及組織類型差異有統計學意義(P<0.05);與年齡差異無統計學意義(P>0.05)。KRAS基因突變更容易發生于男性患者8.87%(11/124),性別差異有統計學意義(P<0.05);與年齡、組織類型差異無統計學意義(P>0.05)。BRAF基因突變率1.11%(2/180),與臨床病理特征無明顯相關(P>0.05)。見表1。

2.3 NSCLC中ALK和ROS1融合基因與臨床病理特征關系 融合基因陽性率為5.56%(10/180),其中ALK陽性率在年齡小于60歲患者6.58%(5/76),男性患者4.84%(6/124),腺癌患者5.19%(8/154)中較高,但與年齡、性別、組織類型差異均無統計學意義(P>0.05)。ROS1融合基因突變率1.11%(2/180),與臨床病理特征無明顯相關。見表2。

表2 ALK、ROS1基因突變與臨床病理特征的關系

2.4 5種驅動基因在不同標本類型中的檢測情況EGFR基因在手術標本突變率為36.00%(9/25),活檢標本突變率為41.25%(33/80),轉移病灶標本突變率為43.48%(20/46),細胞塊標本突變率為37.93%(11/29),轉移病灶標本突變率較高,但不同標本類型突變率比較差異無統計學意義(P>0.05)。KRAS基因在手術標本突變率為8.00%(2/25),活檢標本突變率為6.25%(5/80),轉移病灶標本突變率為6.52%(3/46),細胞塊標本突變率為3.45%(1/29),不同標本類型突變率比較差異無統計學意義(P>0.05)。ALK基因在手術標本突變率為8.00%(2/25),活檢標本突變率為5.00%(4/80),轉移病灶標本突變率為4.35%(2/46),細胞塊標本突變率為0.00%(0/29),不同標本類型突變率比較差異無統計學意義(P>0.05)。BRAF基因突變手術標本及轉移病灶標本各1例。ROS1基因活檢標本及轉移病灶標本各1例。見表1、2。

3 討論

根據國家癌癥中心2019年公布的癌癥統計數據顯示,我國肺癌的發病率和死亡率居所有惡性腫瘤之首[7]。近年來,隨著新的檢測技術和針對NSCLC不同驅動基因的發現,以及靶向治療藥物的不斷研發上市,靶向藥物治療在腫瘤治療中愈發重要,更加促進了NSCLC驅動基因的檢測。標本來源及腫瘤細胞DNA的質量是檢測的前提,DNA質量及低腫瘤細胞比例會影響驅動基因的檢出率,李玉勤[8]報道標本質量不佳會引起假陰性。本研究采用的ARMS法是針對驅動基因突變設計特異的突變引物,確保了高度特異性,是一種高靈敏度的檢測方法,靈敏度可低至1%,適合于活檢及細胞蠟塊等各種不同樣本類型的檢測。該檢測方法還有操作簡易,結果易于判讀,報告周期短等優勢,目前在各級醫院驅動基因檢測中廣泛使用。

EGFR基因其酪氨酸激酶區域的激活即磷酸化對腫瘤細胞生長、腫瘤侵襲及細胞凋亡等相關信號傳遞具有重要意義[9-11],突變患者可從酪氨酸激酶抑制劑靶向治療中獲益。既往研究表明亞洲NSCLC人群EGFR突變率為30%～50%[12],主要以19DEL和L858R突變為主,約占EGFR突變的90%[13]。本實驗中EGFR突變率為40.56%,其中19Del突變及L858R突變占89.04%,稀有突變占10.96%,與上述文獻報道相近。本研究發現女性、腺癌患者的EGFR突變率明顯高于男性、非腺癌患者,兩者比較差異有統計學意義(P<0.05),而與患者年齡和標本類型無關(P>0.05),與既往報道一致[9,14]。KRAS基因是EGFR信號通路的下游調控基因,在EGFR信號傳導通路中起著分子開關作用,KRAS基因突變是EGFR-TKIs耐藥的重要原因之一[15]。本研究中KRAS基因突變率為6.11%,以2號外顯子的12密碼子為主;男性患者KRAS突變率高于女性,差異有統計學意義(P<0.05),研究發現老年、肺腺癌患者陽性率較高,但突變與患者年齡、組織類型無關,與李潔等[16]報道基本一致。BRAF基因突變導致信號通路的改變和激酶活性的增加,從而促使腫瘤的產生及轉移[17],BRAF基因突變患者可在RAF抑制劑威羅菲尼和達拉菲尼治療中獲益。有研究表明BRAF在NSCLC患者中突變率為1%～8%,與患者性別、年齡及組織學類型等無關[18]。本研究中BRAF基因突變率1.11%,與上述文獻報道相近。

ALK基因常與棘皮動物微管蛋白4(Echinoderm microtubuleassociated protein like 4,EML4)形成EML4-ALK融合基因,從而激活ALK酪氨酸激酶區、下游PIK3/AKT及MAPK等信號通路導致腫瘤的發生[19]。ROS1基因與ALK在氨基酸序列上有49%的相似,在酪氨酸激酶催化區的ATP結合位點同源性也高達77%[20]。ALK及ROS1基因融合患者在ALK/ROS抑制劑中明顯受益。有研究表明EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中的陽性率為3%～7%[21],ROS1融合基因在NSCLC患者中的陽性率為1.0%～3.4%[22]。本研究中ALK融合基因突變率4.44%,ROS1融合基因突變率1.11%,與上述文獻報道相近。研究發現ALK基因融合更好發于年齡小于60,男性,腺癌患者,但與年齡、性別、組織類型及標本類型突變率差均異無統計學意義(P>0.05)。ROS1融合基因突變患者因例數過少無法進行統計分析,后續將繼續積累數據進行探討。

本研究組前期報道活檢小標本、轉移病灶標本及細胞蠟塊等不同標本類型可用于EGFR基因檢測[9,23],結果發現其他驅動基因突變也可在此類不同標本類型中檢出,且突變率與標本類型之間差異無統計學意義,從而為臨床根據患者實際情況選擇合適的標本類型提供了依據,增加了基因檢測的取材途徑。本研究4種不同標本類型,雖均可檢出驅動基因突變,但實驗發現血性胸水細胞蠟塊標本因含大量紅細胞及炎細胞,腫瘤細胞比例往往較低,在制作細胞蠟塊前可用免疫磁珠陰性富集法富集腫瘤細胞能有效提高腫瘤細胞比例[24];對于活檢標本因腫瘤大小、活檢部位及腫瘤異質性存在取樣誤差,導致腫瘤細胞數量往往有限,故對基因檢測切片前及切片后的HE切片進行細胞分析,可大致評估出樣本中的腫瘤細胞數和比例,對于腫瘤細胞數及比例過低的樣本,可采取顯微切割的方法對切片中的腫瘤細胞進行富集,以提高腫瘤細胞的比例,從而達到ARMS法檢測閾值[25];轉移病灶標本,特別是骨轉移標本切片時常因骨組織而難以切片,取材前需置于酸性條件下進行脫鈣處理,引起DNA的降解及片段化,從而導致PCR的擴增效率下降,對于骨轉移組織樣本可采用表面脫鈣法,脫鈣后流水沖洗,可有效降低浸泡法對細胞DNA的降解,并在上機時適當增加上樣濃度,可增加此類樣本實驗的檢出率。綜上可知,手術標本為首選樣本,在患者無法手術的情況下活檢標本、轉移病灶標本及細胞蠟塊標本也可作為有效檢測樣本,對于少數無法獲得組織學或細胞學標本的晚期患者,可用血液替代檢測[6]。

早期研究認為NSCLC的基因突變是相互獨立、相互排斥的,近年來有文獻報道雙驅動基因共突變在NSCLC中可以共存[26]。本研究未發現不同驅動基因之間的共存突變,可能與腫瘤異質性、樣本量不夠大有關,在后續的檢測中繼續積累數據探討。本實驗EGFR基因手術標本突變率低于其他標本類型,可能與手術標本量較少有關,也證實我國NSCLC患者一經發現大多失去最佳的手術機會,后續的檢測中將繼續積累數據探討;轉移病灶樣本EGFR突變率最高,可能與突變導致腫瘤高負荷,更易導致腫瘤生長、侵襲及轉移有關[27]。實驗中活檢標本及細胞蠟塊標本經過HE及免疫組化的連續切片,導致樣本的損耗,以往單基因多次檢測造成樣本的不足,且提供的基因信息有限,多基因聯合檢測相比單基因檢測能一次測出多種基因狀態,為臨床治療提供更多指導信息,同時解決樣本量不足的問題,也可縮短報告周期。

4 結論

不同類型標本均可用于驅動基因檢測,增加了患者基因檢測取樣途徑,并分析與臨床病理特征的關系,從而篩選出適合基因檢測的NSCLC患者,為患者靶向藥物治療提供更多基因信息參考和依據。