miR-495-3p、miR-181d-5p在宮頸癌患者中的表達(dá)及臨床意義

安國靜,趙丹丹,仝亞坤,李 靜,李 敏,杜 巍,姚文娟

(1. 河北中石油中心醫(yī)院,河北 廊坊 065000;2. 石家莊市第四醫(yī)院,河北 石家莊 050000;3. 石家莊市第三醫(yī)院,河北 石家莊 050000;4. 望都縣中醫(yī)醫(yī)院,河北 望都 072450;5. 邢臺(tái)市任澤區(qū)人民醫(yī)院,河北 邢臺(tái) 055150)

宮頸癌是全球女性中常見的婦科惡性腫瘤,每年約有50萬例新發(fā)病例和導(dǎo)致超過26萬例患者死亡[1-2]。目前最常用的宮頸癌篩查方法為高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測(cè)和宮頸細(xì)胞學(xué)檢查[3],但HPV檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值低,在HPV檢測(cè)陽性的人群中,實(shí)際發(fā)生或?qū)l(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變或?qū)m頸癌的患者很少,可能導(dǎo)致HPV陽性婦女產(chǎn)生不必要的心理焦慮,甚至過度診療[4];宮頸細(xì)胞學(xué)檢查敏感性較低,而且結(jié)果判斷有較大的主觀性[5]。因此,探索對(duì)初篩HPV陽性婦女進(jìn)行分層篩查的方法意義重大。MicroRNA(miRNA)是一類在大多數(shù)動(dòng)植物細(xì)胞中長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,可調(diào)節(jié)從線蟲到人類以及哺乳動(dòng)物廣泛細(xì)胞過程中的基因表達(dá)[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),部分miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生有關(guān)[7],如miR-495-3p、miR-181d-5p在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá),且與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡密切相關(guān)[8-9],但是,目前的研究尚未證實(shí)二者與宮頸癌具有明顯相關(guān)性。基于此,本研究通過檢測(cè)miR-495-3p、miR-181d-5p在不同程度宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)情況,并分析二者與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系,探討二者對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 宮頸低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(CINⅠ級(jí))、宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí))診斷依據(jù)《第 5 版 WHO 女性生殖器官腫瘤分類》標(biāo)準(zhǔn);宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2018年NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南(第一版)》[10],并經(jīng)CT、MRI檢查及病理活檢確診。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述CINⅠ級(jí)、CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)和宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡30～70歲;③取宮頸組織前均未經(jīng)過放、化療及生物免疫治療;④臨床資料完整,對(duì)取宮頸組織檢查均知情同意并簽署知情同意書。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①接受過放、化療及生物免疫治療的宮頸癌患者;②合并嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝腎功能異常、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等可能影響miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)的疾病者;③伴有精神障礙、認(rèn)知障礙者;④不能配合檢查治療或資料不全者;⑤妊娠及哺乳期者。

1.4研究方法 收集2020年6月—2022年12月河北中石油中心醫(yī)院收治的30例CINⅠ級(jí)(CINⅠ級(jí)組)、30例CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)(CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)組)、50例宮頸癌(宮頸癌組)患者資料及宮頸組織標(biāo)本。采用免疫組化法檢測(cè)各組宮頸組織中miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)情況,比較各組miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)率;采用RT-PCR法檢測(cè)宮頸癌組患者癌組織中miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)量,分析miR-495-3p和miR-181d-5p表達(dá)量與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系、miR-495-3p和miR-181d-5p對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值及二者在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。本研究符合《赫爾辛基宣言》倫理學(xué)要求并經(jīng)河北中石油中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5miR-495-3p和miR-181d-5p表達(dá)檢測(cè)方法

1.5.1免疫組化法 取3組患者經(jīng)石蠟包埋的宮頸組織切片(厚度6 μm),將其分別于二甲苯、無水乙醇及磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行脫蠟處理,隨后將切片置于檸檬酸抗原回收緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原回收。室溫下,使用3%的過氧化氫處理切片15 min,隨后將處理過的切片在5%山羊血清中孵育30 min(37 ℃);在每張切片上分別滴加稀釋好的一抗(miR-495-3p 1∶200,miR-181d-5p 1∶400,抗體購于美國Proteintech有限公司),4 ℃孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200稀釋,購于美國Proteintech有限公司),室溫下放置50 min。切片用DAB顯色,蘇木精復(fù)染、脫水,并用中性樹膠固定,使用B034熒光倒置生物顯微鏡(×200)采集照片,miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)呈棕黃色。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無染色(與背景顏色相似)記0分,輕度染色(淡黃色)記1分,中度染色(棕黃色)記2分,重度染色(棕褐色)記3分;陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞數(shù)<10%記0分,10%～20%記1分,21%～45%記2分,46%～75%記3分,>75%記4分。最終根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)染色強(qiáng)度乘積判定染色結(jié)果:≤1分為陰性,2～5分為陽性,≥6分為強(qiáng)陽性,陽性和強(qiáng)陽性記為陽性表達(dá)[11]。

1.5.2RT-qPCR法 取冷凍的宮頸癌組織標(biāo)本,加入Trizol試劑裂解組織并提取總RNA,隨后利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。利用Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(美國Thermo Scientific公司),在T100 Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后利用SYBR PCR master Mix(美國Invitrogen公司)在熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)中進(jìn)行擴(kuò)增并定量檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)條件:在95 ℃下初始變性15 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,55個(gè)循環(huán),設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。目的基因引物序列:miR-495-3p 上游引物序列為5’UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUU 3’下游引物序列為 5’CAACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU 3’;miR-181d-5p上游引物序列為5’TGATTCAGCCAAGAGCTCGC 3’miR-181d-5p下游引物序列為5’AGGAGTCCCACCATCTGACA 3’;β-actin上游引物序列為5’GCACCATGAAGATCAAGATCATT 3’β-actin 下游引物序列為5’TAACAGTCCGCCTAGAAGCATT 3’。

2 結(jié) 果

2.1各組患者一般資料 CINⅠ級(jí)組患者年齡30～68(48.4±3.5)歲。CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)組患者年齡32～68(50.1±4.2)歲。宮頸癌組患者年齡30～70(50.6±3.6)歲;FIGO分期:Ⅰ期11例,Ⅱ期13例,Ⅲ期16例,Ⅳ期10例;浸潤深度:肌層浸潤深度<1/2者28例,肌層浸潤深度>1/2者22例;分化程度:低度分化16例,中度分化18例,高度分化16例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;病理分型:鱗癌34例,腺癌16例。

2.2各組患者宮頸組織中miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)率 宮頸癌組miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)率均明顯低于CIN Ⅰ級(jí)組及CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)組(P均<0.05),CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)率均明顯低于CIN Ⅰ級(jí)組(P均<0.05)。見表1。

表1 miR-495-3p、miR-181d-5p在不同組織中的陽性表達(dá)率比較 例(%)

2.3宮頸癌組織中miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)量與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)量與患者年齡、病理類型無明顯相關(guān)性(P均>0.05); miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)量與FIGO分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性(P均<0.05),且miR-181d-5p表達(dá)量與分化程度有相關(guān)性(P<0.05),其中FIGO分期越高、浸潤越深miR-495-3p和miR-181d-5p表達(dá)量越低,分化程度越高miR-181d-5p表達(dá)量越低。見表2。

表2 miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理特征關(guān)系

2.4miR-495-3p、miR-181d-5p對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值 與miR-495-3p、miR-181d-5p單一檢測(cè)相比,miR-495-3p、miR-181d-5p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值更高(P=0.001)。見表3及圖1。

圖1 miR-495-3p、miR-181d-5p單一及聯(lián)合檢測(cè)診斷宮頸癌的ROC曲線

表3 miR-495-3p、miR-181d-5p單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值

2.5宮頸癌組織中miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)相關(guān)性 宮頸癌組織中miR-495-3p、miR-181d-5p表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.369,P=0.001)。

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程,它從高危型HPV感染開始,發(fā)展為低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL),然后發(fā)展為高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL),最終發(fā)展為浸潤性宮頸癌[12-13]。鑒于宮頸癌的發(fā)病特點(diǎn),世界衛(wèi)生組織確定其是目前唯一可以通過篩查降低浸潤癌發(fā)生率的惡性腫瘤。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明,近100%的宮頸癌患者HPV檢測(cè)呈陽性[14],但僅HPV感染不足以發(fā)展為宮頸癌,一些輔助因子如miRNA的失調(diào)與HPV相關(guān)宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[15-16]。

miRNA參與基因表達(dá)的調(diào)控,在物種之間及進(jìn)化上都具有高度的保守性,所有的真核細(xì)胞生物幾乎都可以有表達(dá)[17]。通常miRNA通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)相互作用來誘導(dǎo) mRNA降解和(或)翻譯抑制,進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為,包括增殖、分化、凋亡[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn),數(shù)百種miRNA的異常表達(dá)與癌癥生物學(xué)的各個(gè)方面密切相關(guān),包括增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移血管生成,這些涉及大多數(shù)類型的人類癌癥,如宮頸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和胃癌等[19]。大約一半的miRNA存在于與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域中,當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí),miRNA通過上調(diào)致癌基因或下調(diào)腫瘤抑制因子參與癌癥的發(fā)病[20]。

miR-495-3p、miR-181-5p均為miRNA基因家族成員,其中miR-495-3p可通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路中的Wnt抑制因子促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[21],其過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,加速細(xì)胞凋亡[22];Tang等[23]研究發(fā)現(xiàn),miR-495-3p在宮頸癌組織中呈低表達(dá),使其過表達(dá)可抑制體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞的致瘤性。Han等[24]研究報(bào)道,結(jié)腸癌細(xì)胞系中 miR-181a-5p 過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制并降低化療耐藥性,調(diào)控miR-181a-5p表達(dá)可能是結(jié)腸癌分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。陳嫣等[25]研究發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p在宮頸癌組織及患者血清中均呈低表達(dá),且其表達(dá)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。以上研究顯示,miR-495-3p、miR-181d-5p與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中miR-495-3p、miR-181d-5p陽性表達(dá)率低,二者的表達(dá)量與患者年齡、病理類型無明顯相關(guān)性,而與臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān),且miR-181d-5p的表達(dá)量隨宮頸癌分化程度增高而降低;miR-495-3p、miR-181d-5p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值更高,且二者表達(dá)存在一定相關(guān)性。

綜上所述, miR-495-3p、miR-181d-5p在宮頸癌組織中低表達(dá),二者表達(dá)量與宮頸癌患者FIGO分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān),二者聯(lián)合檢測(cè)診斷宮頸癌的價(jià)值較高,且兩者共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,但本研究結(jié)果還有待大樣本進(jìn)一步探討證實(shí)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。