降脂通脈飲對(duì)高血脂癥大鼠血脂和PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路的影響

郭錦榮,黃 微,呂丹丹,顏靖文,周芬敏,陸瑞峰

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院,上海 201318)

高血脂癥是一種以脂蛋白合成增加、脂質(zhì)清除減少為特征的脂質(zhì)代謝異常性疾病,是心腦血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子和危險(xiǎn)因素,因此預(yù)防高血脂癥的發(fā)生及發(fā)展非常重要[1-3]。近年來中醫(yī)降血脂的方法屢見不鮮,中醫(yī)認(rèn)為高血脂癥以肝、脾、腎三臟虧虛為本,痰濁、瘀血阻滯為標(biāo),治療應(yīng)以調(diào)理臟腑、清化痰濁為原則。降脂通脈飲具有補(bǔ)虛祛邪、活血化濁之功,本課題組臨床研究證實(shí)其可以有效調(diào)節(jié)高血脂癥患者血脂水平,降低機(jī)體炎癥反應(yīng)[4],但其作用機(jī)制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是多種疾病的病理生理基礎(chǔ),與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可抑制脂質(zhì)合成代謝[5-7]。蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)均參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),PERK/ATF4/CHOP通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路是否參與脂質(zhì)合成代謝尚不明確。為此,本實(shí)驗(yàn)基于PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路觀察了降脂通脈飲對(duì)大鼠血脂的影響,探討了降脂通脈飲調(diào)節(jié)血脂的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠30只,均為雄性,6周齡,體重(148±5)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海健康醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,環(huán)境溫度23～25 ℃,相對(duì)濕度50%～60%,12 h/12 h明暗交替。本研究經(jīng)上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(ZPYYLL-2018-02)。

1.2藥物 降脂通脈飲由茶樹根、制首烏、生山楂、澤瀉、黃精、陳皮、半夏、益母草等組成,各味中藥顆粒劑由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供,批號(hào):23012031。

1.3試劑與儀器 PERK (C33E10) Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,貨號(hào):#3192),ATF4 (D4B8) Rabbit mAb(Cell Signaling Technology,貨號(hào):#11815),CHOP (L63F7) Mouse mAb(Cell Signaling Technology,貨號(hào):#2895),Goat Anti-Rabbit IgG(Elabscience,貨號(hào):E-AB-1034),ProteinFind?Goat Anti-Mouse IgG (H+L)-HRP Conjugate(Transgene,貨號(hào):HS201-01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號(hào):ABI7900);垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠,型號(hào):DYCZ-24DN、DYCZ-40);離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,型號(hào):HI650);水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,型號(hào):JY300);電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司,型號(hào):HW-SY11-KP2)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分成5組,每組6只。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng),同時(shí)灌胃生理鹽水10 mL/(kg·d);其余組大鼠參考文獻(xiàn)[5]給予高脂飼料(含10%豬油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽鹽、0.2%甲硫氧嘧啶、81.3%普通飼料)喂養(yǎng),其中模型組同時(shí)灌胃生理鹽水10 mL/(kg·d),降脂通脈飲低、中、 高劑量組同時(shí)灌胃1.56 mg/(kg·d)、3.125 mg/(kg·d)、6.25 mg/(kg·d)的降脂通脈飲(按照人與動(dòng)物劑量換算確定給藥量),連續(xù)干預(yù)8周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1血脂指標(biāo) 大鼠末次灌胃后禁食12 h,麻醉后頸動(dòng)脈取血,離心取血清,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.5.2頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP mRNA表達(dá)情況 采用qPCR法檢測(cè):取液氮保存頸動(dòng)脈組織,應(yīng)用Trizol法提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組樣品RNA純度。將總RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,以SYBR Premix(10 μL)+cDNA模板(2 μL)+上/下游 引物(各1 μL)+無核酸酶超純水(6 μL)的反應(yīng)體系,上熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),95 ℃預(yù)變性2 min,繼以95 ℃變性20 s,退火15 s,72 ℃延伸30 s,如此反復(fù)40個(gè)循環(huán),結(jié)果采用2-ΔΔCT計(jì)算。引物序列見表1。

表1 PERK、ATF4、CHOP和GAPDH引物序列

1.5.3頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)情況 取大鼠頸動(dòng)脈組織,按照常規(guī)Western blot實(shí)驗(yàn)操作步驟提取總蛋白,測(cè)定蛋白含量;配置SDS-PAGE凝膠,上樣后依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,室溫孵育一抗(1∶1 000)2 h,TBST洗膜3次×5 min;室溫孵育二抗(1∶5 000)2 h,TBST 洗膜3次×5 min;配置 ECL化學(xué)發(fā)光液,在Amersham Imager 600曝光機(jī)下掃描蛋白條帶并拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料均符合正態(tài)分布和方差齊性,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血脂水平比較 模型組血清TC、TG、LDL-C水平均明顯高于正常組(P均<0.05),降脂通脈飲中、高劑量組血清TC、TG、LDL-C水平均明顯低于模型組(P均<0.05),降脂通脈飲高劑量組與降脂通脈飲中劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);各組血清HDL-C水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和高血脂癥各組大鼠血脂指標(biāo)水平比較

2.2各組大鼠頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP mRNA表達(dá)情況比較 模型組PERK、ATF4、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05);降脂通脈飲各組PERK、ATF4、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),且降脂通脈飲高劑量組均明顯低于降脂通脈飲低劑量組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和高血脂癥各組大鼠頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3各組大鼠頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)情況比較 模型組PERK、ATF4、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05);降脂通脈飲中、高劑量組PERK、ATF4、CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量和降脂通脈飲低劑量組CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),且降脂通脈飲高劑量組PERK、ATF4、CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于降脂通脈飲低劑量組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 正常組和高血脂癥各組大鼠頸動(dòng)脈組織中PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)情況

3 討 論

高血脂癥的發(fā)生與高膽固醇飲食、遺傳、環(huán)境因素等密切相關(guān),可引起動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)皮損傷,是心血管疾病的高危因素[8-9]。目前臨床常用的降脂藥物主要有他汀類和貝特類,但這些藥物存在肝腎功能損傷、胃腸反應(yīng)等不良反應(yīng),在一定程度上限制了其臨床使用[10]。因此,探索新的治療藥物勢(shì)在必行。

高血脂癥屬于中醫(yī)“痰濁”“痰飲”“眩暈”“血瘀”等范疇,病因主要包括先天稟賦不足、飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失常、年老體衰等,與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)有關(guān)。溫偉波教授認(rèn)為高血脂癥病機(jī)為各種因素致脾虛,脾虛則運(yùn)化無力,生濕化痰,阻于脈絡(luò)而生瘀,痰濁瘀互結(jié)于脈中而發(fā)本病[11]。周仲瑛教授認(rèn)為高血脂癥與五臟虛損有關(guān),痰、瘀貫穿整個(gè)病理過程,核心病機(jī)為肝腎虧虛、痰瘀阻絡(luò)[12]。馮玲教授認(rèn)為高血脂癥的發(fā)生與郁有關(guān),因郁而氣血失和,水谷精微輸布失調(diào),痰濁、水飲、血瘀互結(jié)而發(fā)[13]。故認(rèn)為肝脾腎不足是高血脂癥發(fā)生的病理基礎(chǔ),痰濁血瘀是其發(fā)生、發(fā)展的病理產(chǎn)物。在治療過程中要根據(jù)不同的病機(jī)特點(diǎn),探本求源,標(biāo)本兼治,治痰莫忘活血,活血莫忘治痰,痰瘀同治。降脂通脈飲中黃芪健脾補(bǔ)中、益衛(wèi)固表,為君藥;半夏、茶樹根、荷葉為臣藥,其中半夏燥濕化痰、降逆和胃,茶樹根活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒,荷葉清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血;君臣相佐,加強(qiáng)健脾益氣化濁之效。佐藥牡丹皮涼血活血散瘀,生山楂消食健胃、行氣散瘀,益母草活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒、利尿消腫,陳皮燥濕健脾化痰,枳殼宣肺下氣、寬胸利膈,生白術(shù)健脾燥濕,桃仁活血化瘀,肉蓯蓉補(bǔ)腎助陽、潤(rùn)腸通便;甘草為使藥,調(diào)和諸藥。全方通過補(bǔ)腎健脾以治本,利濕降濁、活血化瘀以治標(biāo),從而發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用。本研究采用高脂飲食建立高血脂癥大鼠模型,結(jié)果證實(shí)降脂通脈飲可以有效調(diào)節(jié)高血脂癥大鼠血脂水平。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為多功能細(xì)胞器,在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用。正常狀態(tài)下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載和其折疊能力保持平衡狀態(tài),而蛋白質(zhì)合成增加、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)積累、脂質(zhì)過度沉積等可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的紊亂,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]。PERK是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)其磷酸化,從而抑制真核生物起始因子2α(eIF-2α)介導(dǎo)的蛋白翻譯,促使下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4激活,激活的ATF4可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)[15-16]。CHOP是一種應(yīng)激反應(yīng)元件,是成脂分化因子C/EBPβ的主要抑制因子,而C/EBP家族是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,降脂通脈飲中、高劑量組PERK、CHOP、ATF4 mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組,提示降脂通脈飲可抑制PERK/ATF4 /CHOP信號(hào)通路,從而抑制機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述,降脂通脈飲可能通過下調(diào)PERK/ATF4 /CHOP信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá),抑制機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而降低高血脂癥大鼠的血脂水平。本研究為降脂通脈飲的臨床應(yīng)用提供了一定理論依據(jù),但其防治高血脂癥的具體物質(zhì)基礎(chǔ)和深入機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。