基于高通量測序的海州灣沉積物中微生物多樣性分析

顧 穎，伏光輝，王亞東，葉仁智，盧 璐，孫苗苗*

（1.連云港市海洋與漁業發展促進中心，江蘇連云港 222000；2.江蘇海洋大學，江蘇連云港 222000）

海州灣是位于江蘇省連云港市沿岸的開放型淺海海灣，其底質類型豐富、入海河流眾多、生物餌料豐富，是我國重要的漁場之一[1-2]。然而，近年來由于資源保護不當、過度捕撈、環境污染等因素的影響，海州灣資源急劇衰退，影響了海州灣海洋生態系統的可持續健康發展[3]。海洋微生物是海洋生態系統的重要組成部分，參與海洋生物地球化學循環過程，在海洋生態系統的功能中具有重要作用[4-5]。相關研究表明，微生物群落特征的變化會影響海洋碳、氮和磷等營養物的化學循環及微生物的降解功能[6-8]。沉積物在海洋生態系統中通常具有較高的微生物豐度和多樣性，其中的微生物是調節各種生物元素轉化和生物修復的生物地球化學過程的主要執行者[9-10]。因此，對沉積物中微生物多樣性的研究有助于了解海洋微生物群落的分布特征，維持海洋生態資源的可持續發展。目前，對海州灣的研究主要集中在魚類多樣性、浮游動植物多樣性和海洋環境研究等方面[1-3,11-16]，對海州灣沉積物中微生物多樣性的研究較少。鑒于此，本研究以海州灣不同點位的沉積物樣品為研究對象，利用Illumina MiSeq 高通量測序技術，對海州灣水域沉積物的微生物多樣性進行了分析，以期為海州灣海域生態系統的健康發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

參照黃備等[17]的方法進行沉積物樣品采集。沉積物樣品采集于江蘇省連云港市海州灣，采樣點布設如表1所示。每個點位各采集3 g沉積物，3次重復。

表1 海州灣采樣點布設

1.2 DNA提取及高通量測序

參照張帥等[18]的方法，稱取0.5 g 新鮮沉積物樣品，采用磁珠式土壤基因組DNA 提取試劑盒（Omega公司，美國）提取樣品總群落基因組DNA，利用Qubit 4.0（Thermo 公司，美國）檢測DNA 濃度后，對細菌16S rRNA基因的V3-V4區進行PCR擴增。擴增后的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用Illumina MiSeq系統（Illumina MiSeq，USA）進行雙端測序。

1.3 數據分析

對高通量測序得到的樣本數據進行質控過濾以得到有效數據[19-21]。利用Usearch 11.0.667 軟件將相似性＞97%的序列聚類為一個OUT[22-23]。通過Mothur 1.43.0軟件計算序列的α-多樣性指數[24]，其中，Chao1和Ace指數用于評估群落分布豐度，Shannon和Simpson指數用于評估群落分布多樣性，Shannoneven指數用于評估群落分布均勻度，Coverage 指數能夠反映測序結果是否代表樣本的真實情況。

2 結果與分析

2.1 微生物α-多樣性分析

對海州灣水域各樣點采集樣品進行α-多樣性分析，多樣性指數統計結果見表2。Shannon 指數越大，Simpson指數越小，說明微生物群落多樣性越高。RA8點位沉積物樣品的Shannon 指數最大（6.192），且Simpson指數最小（0.007），表明RA8點位沉積物樣品的微生物群落多樣性最高。各采樣點沉積物樣品的Chao1 指數和Ace 指數不同，表明不同沉積物樣品的微生物群落豐度不同。此外，各樣品的Coverage 指數均接近1（p＜0.01），表明樣本測序結果能夠代表樣本微生物的真實情況。

表2 海州灣水域各樣點細菌群落α-多樣性指數分析

2.2 微生物PCoA分析

基于UniFrac 距離算法，在OUT 水平上，對海州灣沉積物樣品進行主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）。結果如圖1（見封三）所示，坐標軸PCo1 能解釋45.67%的微生物群落組成差異，第二坐標軸PCo2 能解釋25.67%的微生物群落變化。在PCo1維度上，RA8點位的沉積物樣品與其他點位的沉積物樣品距離均較遠，表明RA8 點位與其他點位的沉積物樣品的微生物群落結構差異較大。此外，CA3、RA6 點位沉積物樣品的微生物群落結構差異較小，CA1、RA9、RA16 點位沉積物樣品的微生物群落結構差異較小。

2.3 微生物群落組成分析

通過blastn 將序列與RDP、GTDB、NCBI、Silva和UNITE 等數據庫進行比對，進行物種注釋，海州灣沉積物樣品中共發現2 851 個OUTs，分屬于31 門74綱116 目199 科331 屬。門水平上（圖2，見封三），海州灣水域主要優勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和硬壁菌門（Firmicutes）等8 類。其中，各采樣點的第一優勢門類均為變形菌門，分別占各樣品細菌群落豐度的62.39%、53.15%、54.30%、57.97%、56.09%、58.93%。除RA8、CA3 點位外，擬桿菌門在其他點位沉積物中的含量僅次于變形菌門，平均相對豐度為7.76%。

選取在屬水平上相對豐度排名前22位的細菌優勢菌屬做熱圖分析，如圖3（見封三）所示，顏色越紅表示物種相對豐度越高，越綠表示相對豐度越低。不同點位的沉積物樣品中的優勢菌屬存在一定差異。RA8點位沉積物樣品中相對豐度最高的菌屬為Gp10，相對豐度為3.38%，Sulfurovum（2.23%）、Thioprofundum（3.17%）和Gp23（2.28%）也是RA8 點位沉積物樣品中的優勢菌屬，平均相對豐度均超過2%；Sulfurovum是RA6、RA16 點位沉積物樣品中的最優勢菌屬，相對豐度分別為10.43%、6.02%；Thioprofundum是RA9、CA1 點位沉積物樣品中的最優勢菌屬，相對豐度分別為3.40%、3.94%；此外，CA3點位沉積物樣品中相對豐度最高的菌屬為Gp10，相對豐度為3.36%。

應用屬水平的Venn 圖分析6 個點位沉積物樣品的微生物群落差異（圖4，見封三）。6 個點位樣品共有的物種有191 個屬，特有的物種分別為CA3 點位4 個，RA6 點位3 個，RA8 點位9 個，RA9 點位3 個，RA16點位6個，CA1點位4個。表明6個點位微生物的種類組成具有較高的相似性，各點位特有的微生物種類較少。

2.4 共表達網絡分析

通過計算物種之間的相關性，建立物種相關性網絡，共表達網絡特征值如表3所示，共表達網絡如圖5（見封三）所示。16 個節點間有27 條表示種間強相互作用的連接（p＜0.05，r＞0.8），平均路徑長度是1.65，網絡直徑為4，緊密系數為0.64。網絡中的節點主要屬于變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和放線菌門4個菌門，也是細菌群落的優勢菌門。

表3 共表達網絡特征值

2.5 FAPROTAX分析

通過FAPROTAX 軟件分析預測微生物的功能，樣本細菌的FAPROTAX 功能豐度熱圖如圖6（見封三）所示。結果表明，各采樣點沉積物樣品的功能豐度基本相似，微生物的主要功能與硫化合物呼吸（respiration of sulfur compounds）、亞硫酸鹽呼吸（sulfate respiration）、化能異養（chemoheterotrophy）、有氧化能異養（aerobic chemoheterotrophy）、發酵（fermentation）、硫酸鹽呼吸（sulfite respiration）、光合作用（chloroplasts）、光合營養（phototrophy）、光能自養（photoautotrophy）、無氧光能自養（anoxygenic photoautotrophy）、硝化（nitrification）、亞硝酸鹽氧化（aerobic nitrite oxidation）、尿素分解（ureolysis）、含硫化合物暗氧化（dark oxidation of sulfur compounds）、動物寄生蟲共生體（animal parasites or symbionts）、硫暗氧化（dark sulfur oxidation）、亞硫酸鹽暗氧化（dark sulfite oxidation）、硝酸鹽還原（nitrate reduction）及光能異養（photoheterotrophy）等有關。其中，硫化合物呼吸占5.9%～10.68%，亞硫酸鹽呼吸占5.74%～10.61%，化能異養占6.1%～7.38%。

3 討論

海洋沉積物是海洋生態系統中主要的微生物聚集地，蘊藏著豐富的微生物資源，多種營養物質轉化在此進行，是參與生物地球化學循環的重要環節[25]。海洋沉積物中微生物多樣性在維持海洋生態系統平衡的過程中非常重要，其相關研究已成為熱點。在門水平上，變形菌門廣泛參與海洋的生物地球化學循環過程，在有機物分解和循環中有重要作用[26]。白潔等研究發現黃海西北部沉積物樣品中的變形細菌門在所有樣品中均為優勢菌門[27]；劉欣等研究發現膠州灣海域表層沉積物樣品中絕對優勢菌群為變形菌門[28]；黃備等研究發現椒江口海域沉積物樣品中的最主要優勢門為變形菌門[29]；有小娟等研究發現變形菌門為象山港內西滬港海域沉積物樣品中的最主要優勢門[30]。本研究中，變形菌門在海州灣各個點位的相對豐度均最高，在細菌群落中占絕對優勢，與國內已報道的黃海、威海、膠州灣、椒江口及西滬港等海域沉積物樣品的最大優勢類群相同[27-31]。除變形菌門外，海州灣沉積物樣品中還發現擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門和硬壁菌門等優勢細菌門，這些菌門在我國近海沉積物微生物群落中均有報道[32-34]。此外，海州灣不同點位沉積物樣品間的優勢菌屬及海州灣與其他海域沉積物間的優勢菌屬均存在較大差異，可能與環境溫度、季節、深度等環境條件及受陸地、人類活動影響不同有關[28,35]。

微生物群落間的相互作用對維持生態系統結構功能穩定具有重要意義，對微生物群落共現網絡的研究能夠進一步認識微生物之間的相互作用[36-37]。楊艷等研究發現長江三峽上游水域樣品微生物共現網絡中的節點主要屬于變形菌門、藍細菌門和擬桿菌門，占所有節點的87.5%[37]；王洵等研究發現橫山水庫表層水樣和底層水樣微生物共現網絡中的主要優勢物種為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門[38]。本研究發現，海州灣沉積物樣品共現網絡中，大多數節點屬于變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和放線菌門，與其他微生物相比，這些微生物在維持網絡結構和功能中起重要作用[37]。如變形菌門、綠彎菌門和放線菌門廣泛參與碳、氮、硫等一系列重要元素生物地球化學循環過程，酸桿菌門在各生態系統中均具有特定的驅動作用及菌群穩定性功能[39-44]。此外，相關研究表明，豐度較高的中心微生物能夠通過數量變化，豐度較低的中心微生物能夠通過介體、傳遞及聯絡等功能影響微生物群落的結構組成和多樣性[37,45]。

海洋沉積物中的微生物驅動碳、氮和硫等許多的生物地球化學循環[46]。FAPROTAX 預測的功能集中在海洋和湖泊中微生物的生物地球化學循環，適用于有關S 循環、N 循環、H 循環及C 循環等的功能預測[47]。例如，王璐采用FAPROTAX 軟件對黃海北部海洋牧場海水和沉積物細菌群落進行功能預測，研究發現黃海海水和沉積物微生物優勢功能類群主要與碳、氮元素循環有關，包括化能異養、有氧化能異養、光合作用、光合營養、光能自養、有氧光能自養、硝化、氨氧化、發酵、硝酸鹽還原等[48]；李明月等通過FAPROTAX 數據庫預測渤海和南黃海表層沉積物中細菌功能，研究發現目標站位沉積物中蘊含著活躍的硫化合物呼吸、硫酸鹽呼吸、化能異養、有氧化能異養、光合作用、硝化及好氧亞硝酸鹽氧化等硫循環、碳循環和氮循環功能[49]。在本研究中，通過FAPROTAX 預測發現海州灣沉積物樣品中的微生物與硫化合物呼吸、亞硫酸鹽呼吸、化能異養、有氧化能異養、發酵、硫酸鹽呼吸、硝化、亞硝酸鹽氧化等硫循環、碳循環和氮循環等功能有關，主要參與生物地球化學循環中的硫循環。