阿蓬江黔江段干支流水體微生物群落特征分析

許田甜，田茂強，劉朝紅，李小林，胡廷英

[1.重慶新陽地理信息有限公司，重慶 401147；2.自然資源部重慶典型礦區(qū)生態(tài)修復野外科學觀測研究站（重慶地質(zhì)礦產(chǎn)研究院），重慶 401120；3.長江師范學院綠色智慧環(huán)境學院，重慶涪陵 408100]

我國水體微生物研究主要集中在長江[1]、黃河[2]等主要河流地，以及鄱陽湖[3]等典型湖泊，對于支流等小型河流、湖泊及其他小型水域的微生物缺乏研究。河流生態(tài)系統(tǒng)中，浮游細菌是重要組成部分，在水體中浮游細菌數(shù)量龐大，代謝活動強烈，是高級生物的主要食物，對水中污染物的降解和水循環(huán)過程有重要作用[4]。在水生態(tài)系統(tǒng)中，微生物對水體外的環(huán)境因子的變化十分敏感。近年來，眾多學者研究了浮游細菌與環(huán)境因子之間的相關(guān)性[5]，但大都集中在海洋和湖泊[6]。河流作為一個動態(tài)系統(tǒng)，它們的環(huán)境條件在時間和空間尺度上具有高度差異性[7]。相關(guān)研究[8]表明其在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中優(yōu)勢類群均是變形菌門，且大多數(shù)在生物脫氮除磷和污染物降解過程中起重要作用的微生物也是變形菌門[9]。在綱水平上，β-變形菌綱占據(jù)的比例最大，達到了11.01%到31.50%不等，其大多數(shù)存在于河流和湖泊中（松花江[10]、海寧長山河[11]、東江[12]、Prealpine 湖[13]等），對氮、磷等污染物的降解起到了重要的作用[14]。

本研究選擇阿蓬江（黔江段）為研究區(qū)域，對其水體中的微生物種類、多樣性和群落分布特征進行分析，以期為觀察阿蓬江水污染狀況，為長江上游水環(huán)境保護和長江流域微生物群落特征和多樣性研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

阿蓬江（黔江段）位于重慶市黔江區(qū)南部，全長約60 km。主要支流有太極河、細沙河、段溪河及黔江河等河流。于2019年在阿蓬江（黔江段）干支流中設(shè)定11 個樣點并取樣，其中支流設(shè)有4 個樣點，分別是QW1、QW7、QW9、QW11 樣點，其余7 個全是干流樣點。

1.2 水體微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.2.1 水體微生物總DNA提取

水樣通過0.22 μm 的濾膜進行抽濾，過濾好后的濾膜放置在無菌離心管中于-20 ℃保存，并使用15 kg干冰送測。

1.2.2 水體微生物高通量DNA測序

用特定的DNA 提取試劑盒進行基因組DNA 提取后，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。16S 引物使用：341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') 和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物進行PCR。每一個25 μL 的體系包括1×PCR buffer、1.5 mM MgCl2、0.4 μM dNTPs、正向和反向引物各1.0 μM、0.5 U KOD-Plus-Neo 酶(TOYOBO) 和10 ng 模板。PCR 程序包括起始94 ℃1 min,然后30 循環(huán)(變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和 延伸72 ℃30 s)，最后72 ℃5 min。每個樣本進行3 個PCR 技術(shù)重復。PCR 與1/6 體積的6×loading buffer 混合，用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。取目的條帶用來回收，回收使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)。用 Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)定量。最后等摩爾量混合。建庫使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和文庫檢測合格后，使用羅寧生物的Miseq 平臺PE300 模式測序。測序工作在上海羅寧生物有限公司進行。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

高通量測序產(chǎn)出的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA軟件進行堿基識別后轉(zhuǎn)化為原始的測序序列，稱為Raw Data 或Raw Reads，結(jié)果以Fastq 格式儲存。對序列進行質(zhì)控，得到高質(zhì)量序列，質(zhì)控后得到的序列稱為Clean Tag。使用UCHIME7 算法去除嵌合體，得到Effective Tag。為了方便研究樣本的物種組成及多樣性信息，對序列進行聚類產(chǎn)生操作時的分類單元，即OTU（Operational Taxonomic Units）。在97%的相似水平下進行OTU 聚類分析，每個OTU 代表的是一類相似序列的集合，通過OTU 聚類分析，得到OTU 豐度表，此豐度表是后續(xù)分析的基礎(chǔ)文件。為防止測序深度對后續(xù)多樣性分析產(chǎn)生影響，對數(shù)據(jù)進行重抽樣，使得各樣本保持一致的序列數(shù)。用Circos 網(wǎng)站在線繪圖功能（http://circos.ca/）對阿蓬江水體微生物種群門、綱、目、科水平的相對豐度變化情況進行可視化表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿蓬江干支流水體微生物組成成分

在阿蓬江（黔江段）區(qū)域所取樣的11個樣點所得的所有細菌16 SrDNA 片段中，將得到的序列按門、綱、目、科分類，可以知道研究區(qū)域所取樣的11個樣點共有27門、46綱、98目、158科。

2.2 阿蓬江干支流水體微生物群落多樣性

通過采用α 多樣性分析，對阿蓬江干支流水體微生物群落多樣性進行表征，包括物種豐富度指數(shù)（Chao 1）、Shannon 多樣性指數(shù)（H’）和Simpson 多樣性指數(shù)（D）（見表1）。對阿蓬江干支流水體樣品測序后，獲得97%相似水平及以上的OTUs分別有約360個和337 個，且對微生物群落覆蓋率達到99%，OTU值干流明顯大于支流。Chao 1 豐富度指數(shù)表現(xiàn)為干流水體大于支流水體，干支流微生物群落OTU 值均低于Chao 1豐富度指數(shù)，Shannon 和Simpson 指數(shù)也均表現(xiàn)為干流水體大于支流水體。總體而言，阿蓬江水體微生物的群落豐富度和多樣性均表現(xiàn)為干流大于支流。

表1 阿蓬江（黔江段）水體微生物群落多樣性指數(shù)分析

2.3 門水平上的微生物群落分布特征

通過高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)細菌群落在門水平上有27個細菌門，其中主要為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門等細菌門，而在這些細菌門中占據(jù)絕對優(yōu)勢的是變形菌門，說明阿蓬江（黔江段）是以浮游細菌組成的典型的淡水水體，符合我國典型的淡水水體微生物組成的群落特征。

從表2 可知，在干流中的優(yōu)勢細菌門是放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門和裝甲菌門，支流中的優(yōu)勢細菌門則是變形菌門、疣微菌門、異常球菌門、芽單胞菌門和奇古菌門，從標準偏差來看，放線菌門、擬桿菌門和異常球菌門在干支流的優(yōu)劣勢并不明顯，擬桿菌門和厚壁菌門雖然在占比上是干流優(yōu)于支流，但是其干流的標準偏差是遠大于支流的，相反的是，異常球菌門在占比上是支流優(yōu)于干流，其標準偏差是支流略大于干流，由此可看出細菌群落在空間的分布上是有一定的空間差異，但其波動幅度不大。

表2 門水平上干支流水體前10位微生物占比 單位：/%

2.4 綱水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測序分析，在綱水平上一共發(fā)現(xiàn)46個細菌綱。從表3 的干支流占比分析來看，干流中的優(yōu)勢細菌綱有放線菌綱和α-變形菌綱，在支流中占據(jù)優(yōu)勢的細菌綱是γ-變形菌綱和擬桿菌綱。從標準差來看，首先γ-變形菌綱在支流中的標準差是要小于干流，其次是放線菌綱、擬桿菌綱和α-變形菌綱，其標準差均是干流大于支流，最后是疣微菌綱和Acidimicrobiia，這兩大細菌綱在干支流中的標準差相距太大，疣微菌綱在支流中的標準差是干流中的4倍，Acidimicrobiia 在干流的標準差是支流的3 倍，所以這兩大細菌綱在干支流中的空間分布有一定的波動幅度。

表3 綱水平上干支流水體前10位微生物占比 單位：%

2.5 目水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

目水平上，一共發(fā)現(xiàn)98 個細菌目，如表4 所示，最優(yōu)勢的細菌目是伯克氏菌目，從干支流占比對比分析，伯克氏菌目在支流中的比例大于干流中所占比例，法蘭克氏菌目干流中所占比例大于支流，從兩者標準差來看，干支流中的空間分布沒有明顯差異。擬桿菌目和鞘脂單胞菌目在干流中的占比略優(yōu)于支流，而其在干流中的空間分布波動相比于支流是比較大的，而剩下的假單胞菌目、噬幾丁質(zhì)菌目、熱纖梭菌目等細菌目的相對比例差距不大，空間波動幅度不明顯。

表4 目水平上干支流水體前10位微生物占比 單位：%

2.6 科水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

科水平上，細菌科較多，所有樣品中一共有158個細菌科，如表5 所示，最優(yōu)勢的細菌科是伯克氏菌科。從干支流的占比來看，支流中占比較大的是伯克氏菌科，而在干流中所占比例較大的是魚孢菌科。從標準差的對比來看，伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科在干流中的空間波動幅度遠大于支流，魚孢菌科、紅桿菌科和假單胞菌科在干支流中的空間分布沒有明顯差異，而未列出的細菌科占據(jù)比例較大，在空間分布上也沒有明顯差異。

表5 科水平上干支流水體前10位微生物占比 單位：/%

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

利用Illumina測序技術(shù)的16S擴增子測序，檢測了阿蓬江（黔江段）水體微生物群落的組成成分，發(fā)現(xiàn)所取樣的11 個樣點共有27 門、46 綱、98 目、158 科。在門分類水平上，變形菌門是11個樣品中最優(yōu)勢細菌門，如吳曉冰等[15]在研究長江干流浮游細菌群落結(jié)構(gòu)中變形菌門（7.49%～85.63%）和張旭[16]在研究海寧市不同類型區(qū)域河流底泥微生物群落結(jié)構(gòu)特征研究時，其中變形菌門為細菌門中最優(yōu)勢類群，均符合典型的淡水水體微生物的組成特征。變形菌門在研究區(qū)域呈現(xiàn)出支流含量高、干流含量低的特征，變形菌門在所有樣點中都是絕對優(yōu)勢類群，說明變形菌門相比其他細菌更具有適應(yīng)性；放線菌門和擬桿菌門作為次優(yōu)勢類群，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出干流含量高、支流含量低的特征；而剩下的厚壁菌門、疣微菌門及浮霉菌門等細菌門的占比相對較低，在10%以下。在綱水平上，γ-變形菌綱是最優(yōu)勢類群，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出支流含量高、干流含量低的特征；其次次優(yōu)勢類群是放線菌綱、擬桿菌綱及α-變形菌綱，在研究區(qū)域呈現(xiàn)出干流含量高、支流含量低的特征；其余的疣微菌綱、厚壁菌綱及β-變形菌綱等細菌綱的占比均不超過10%。γ-變形菌綱、放線菌綱、擬桿菌綱及α-變形菌綱在研究區(qū)域是優(yōu)勢類群，這與我國大多數(shù)淡水生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查結(jié)果是一樣的[17-19]。在目和科水平中伯克氏菌均處于優(yōu)勢地位，其干支流的占比差距明顯。初步分析伯克氏菌在支流上含量高的原因可能是支流采樣點都是河流，其周圍城鎮(zhèn)發(fā)展迅速，其發(fā)展產(chǎn)生的各種污水導致水體污染加劇，其水體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)增多，細菌含量增高。

3.2 結(jié)論

1）通過微生物16S片段高通量測序分析，阿蓬江（黔江段）所取得的11 樣品在界的水平上總共發(fā)現(xiàn)27門、46綱、98目、158科。

2）阿蓬江水體微生物的群落豐富度和多樣性均表現(xiàn)為干流大于支流。

3）在門水平分類上，以變形菌門為絕對優(yōu)勢類群，在綱水平分類上則是以γ-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢類群，在目分類上以伯克氏菌目為優(yōu)勢類群，在科分類上以伯克氏菌科占據(jù)絕對優(yōu)勢。

4）基于高通量測序數(shù)據(jù)分析，干支流空間差異較為明顯，在門水平上，擬桿菌門和厚壁菌門在干流中的空間分布波動幅度較大，疣微菌門和芽單胞菌門在支流中的空間分布有較大差異。綱水平上，疣微菌綱在支流的標準差是干流的4 倍，Acidimicrobiia 在干流的標準差是支流的3 倍，所以這兩大細菌綱在干支流中的空間分布有一定的差異。在目分類上，細菌目的空間分布有一定的差異，但熱纖梭菌目、Microtrichales 和Selenomonadales 在分布上差異較大。在科分類上，細菌科的空間分布沒有明顯的差異，其中的鞘脂單胞菌科、Ilumatobacteraceae 和氨基酸球菌科的空間分布有些波動。