多年生黑麥草的防御機制對模擬酸雨和鎘復合脅迫的響應

邱 萍，凌顯容，郭 巧，胡 霞*

(1.樂山市實驗中學，四川樂山 610040；2.樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000)

酸雨是指pH 值小于5.6 的降水，是因人類活動或自然災害（森林火災、火山爆發等）導致降水酸化的一種污染現象[1]。中國酸雨主要分布在四川盆地及長江以南、青藏高原以東的大部分地區。酸雨不僅對植被產生直接影響，還造成水源及土壤酸化，帶來嚴重的生態環境問題[2]。近年來，由于工業活動、城市化進程的快速發展，以及污水灌溉、施用劣質肥料等農業活動，重金屬污染問題愈發嚴重。在所有非植物必需的重金屬元素中，鎘容易在人體內聚集，最難以修復也最引人關注。據普查，目前全國約有1.3萬hm2耕地遭受鎘污染，有些地區的農田污染嚴重超標[3]。重金屬進入土壤后被植物吸收，不僅影響植物的生長發育，還會通過食物鏈積累，最終危害人類健康。酸雨與土壤中重金屬有效態含量的多少有一定程度的關系，在酸雨作用下，土壤中重金屬在一定程度上被活化，加重了對植物的損害。此外，重金屬也會加重酸雨對植物的傷害。在我國，酸雨和鎘污染對土壤造成的環境問題非常嚴重，并且我國酸雨區與重金屬污染區有很大程度重疊。目前，國內對酸雨和鎘單一脅迫的研究均較多，但對兩者的復合脅迫研究相對較少。

多年生黑麥草是禾本科黑麥草屬草本植物，在我國長江流域、四川、貴州、湖南、云南等地生長良好，具有生長快、生物量大、根系發達、適應性強、耐酸等優點，并且對銅、鎘、鉛和鋅等多種重金屬均有一定的耐性，可在重金屬復合污染的土壤上正常生長[4]。因此，本試驗以多年生黑麥草為材料，研究其種子萌發及幼苗生長生理對酸雨和鎘復合脅迫的響應，為修復酸雨和鎘污染的土壤及環境治理提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 模擬酸雨和氯化鎘溶液的配制

模擬酸雨的配制：根據四川地區歷年的降雨酸度，參照文獻配制模擬酸雨[5-7]。按SO42-∶NO3-為8∶1(V/V)，配成pH值1.0的酸雨母液，使用時以蒸餾水稀釋，借助pHS-3C 型精密酸度計（上海佑科儀器儀表有限公司）用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調配模擬酸雨的pH值分別為2.5、6.0、7.0。

氯化鎘溶液的配制：先配制1 g·L-1的氯化鎘母液，然后用蒸餾水分別稀釋標定后的母液，配制氯化鎘溶液濃度分別為0、0.5、20.0 mg·L-1。

1.2 試驗設計

挑選大小一致、種胚完好、籽粒飽滿的多年生黑麥草種子（Lolium perenne L.），用1 g·L-1氯化汞溶液浸泡10 min 消毒，然后用大量蒸餾水反復沖洗，瀝干水分后將100 粒多年生黑麥草種子均勻擺放在直徑為12 mm、墊有3層濾紙的培養皿中（培養皿和濾紙事先經滅菌處理后冷卻至室溫）。每個培養皿分別倒入不同濃度的模擬酸雨和鎘復合脅迫溶液10 mL。復合脅迫處理為：pH 值6.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅰ），pH 值6.0+Cd 40.0 mg·L-1（處理Ⅱ），pH 值3.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅲ），pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1（處理Ⅳ），pH 值7.0+Cd 0 mg·L-1（CK）。每個處理重復3次。將培養皿放于20 ℃的恒溫光照培養箱內進行常規培養。每2 d添加1次相應濃度的脅迫溶液。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 種子發芽統計

種子發芽統計以突破種皮的胚軸長度達到種子自身的長度為標準，從試驗第3 d 開始統計每皿發芽的種子數。試驗開始第7 d 計算不同處理下種子發芽率、發芽勢和發芽指數[8]。發芽率、發芽勢、發芽指數的計算公式如下：

發芽率（GR）=（n/N）×100%（1），式中n 為最終達到的正常發芽粒數，N為供試種子數；

發芽勢（GP）=（n3/N）×100%（2），式中n3為種子發芽第3 d的正常發芽粒數，N為供試種子數；

發芽指數（GI）=∑（G7/D7），式中G7為在第7 d的發芽數，D7為相應的發芽天數。

1.3.2 幼苗生長量的測定

試驗開始第7 d 每皿隨機選擇10 粒發芽的多年生黑麥草，測定地上生物量（芽質量）、地下生物量（根質量）和總生物量（芽質量+根質量）。

1.3.3 幼苗生理指標的測定

試驗開始第15 d 隨機采集不同濃度脅迫的多年生黑麥草幼苗葉片，采用丙酮浸提法用T6新悅可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）進行葉綠素含量的測定；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量；采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性；采用DDS-307 電導率儀（上海精密科學儀器有限公司）測定相對電導率[9-10]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2017 進行數據處理及繪圖；用SPSS 13.0 進行單因素方差分析（ANOVA），最小顯著差異法（LSD）比較組間差異。

2 結果與分析

2.1 模擬酸雨和鎘復合脅迫對多年生黑麥草種子萌發的影響

從表1 可以看出，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草種子發芽勢、發芽率和發芽指數均逐漸降低。而隨著模擬酸雨脅迫的加劇，種子發芽卻沒有表現出規律的變化趨勢。低濃度的鎘和弱酸復合脅迫下（處理Ⅰ）種子發芽勢、發芽率及發芽指數均高于對照組，表明此處理不但未對植物造成傷害，反而對多年生黑麥草種子萌發具有一定的促進作用。高濃度的鎘和強酸的復合脅迫（處理Ⅳ）下，多年生黑麥草種子的發芽勢比對照降低了75.9%，發芽率下降了19.5%，發芽指數下降了45.3%，差異達到顯著水平（p＜0.05），種子萌發受到明顯抑制。

表1 多年生黑麥草種子萌發對模擬酸雨和鎘復合脅迫的響應

2.2 模擬酸雨和鎘復合脅迫對多年生黑麥草生物量的影響

從表2 可知，不同濃度的模擬酸雨和鎘復合脅迫處理均降低了多年生黑麥草地上生物量、地下生物量和總生物量。同一濃度酸雨脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草生物量逐漸降低。強酸脅迫時（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）使多年生黑麥草總生物量比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了60.6%。同時，同一濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草生物量也呈現逐漸降低的趨勢，然而差異不顯著。統計分析結果顯示，模擬酸雨和鎘污染的復合脅迫均抑制了多年生黑麥草幼苗的生長，相比于對照，處理Ⅳ復合脅迫使多年生黑麥草地上生物量降低了65.2%，地下生物量降低了73.3%，總生物量降低了67.5%，差異達顯著水平（p＜0.05）。

表2 多年生黑麥草生物量對模擬酸雨和鎘復合脅迫的響應

2.3 模擬酸雨和鎘復合脅迫對多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量的影響

從表3 可知，低濃度的酸和鎘復合脅迫處理（處理Ⅰ）增加了多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量，促進了葉片葉綠素的合成。在相同H+濃度的酸脅迫下，隨Cd濃度升高葉綠素含量降低。然而在相同濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量卻并沒發生改變。高濃度的酸和鎘脅迫下（處理Ⅳ）葉綠素含量最低，為1.1 mg·g-1，顯著低于對照（p＜0.05）。

表3 多年生黑麥草葉綠素含量、細胞膜透性和過氧化物酶活性對模擬酸雨和鎘復合脅迫的響應

2.4 模擬酸雨和鎘復合脅迫對多年生黑麥草細胞膜的影響

從表3 可以看出，不同濃度模擬酸雨和鎘復合脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片丙二醛（MDA）含量均高于對照組。低濃度鎘脅迫時（處理Ⅰ和處理Ⅲ）丙二醛含量僅分別比對照增加了23.5%和6.7%，高濃度鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）下丙二醛含量則分別比對照增加了29.9%和49.5%。高濃度酸和鎘復合脅迫（處理Ⅳ）使黑麥草幼苗丙二醛含量達到最高值，為14.5 mmol·g-1，顯著高于對照（p＜0.05）。

和對照相比，兩種不同H+濃度的酸脅迫下低濃度鎘脅迫（處理Ⅰ和處理Ⅲ）沒有改變多年生黑麥草幼苗葉片的相對電導率值（表3）；而高濃度的鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）均增加了多年生黑麥草葉片相對電導率值，差異達顯著水平（p＜0.05）。處理Ⅱ脅迫下幼苗葉片相對電導率達12.9%，處理Ⅳ達13.9%，分別比對照增加了12.6%和21.2%。

2.5 模擬酸雨和鎘復合脅迫對多年生黑麥草過氧化物酶活性的影響

與對照相比，低濃度的酸脅迫和鎘脅迫（處理Ⅰ）并未顯著改變多年生黑麥草幼苗葉片過氧化物酶（POD）活性。同一H+濃度的模擬酸脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性逐漸降低。弱酸脅迫時（pH=6.0），重度鎘脅迫（處理Ⅱ）使多年生黑麥草POD活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅰ）下降了13.8%；強酸脅迫時（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）的POD 活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了2.7%（表3）。同時，在同一低濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性也呈現降低的趨勢。統計分析結果顯示，高濃度的鎘和不同H+濃度的模擬酸雨復合脅迫（處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）均顯著抑制了POD 活性（p＜0.05）。

3 討論與結論

3.1 討論

全球普遍存在著兩種非生物脅迫：酸雨和重金屬脅迫。酸雨和有毒重金屬污染土壤時具有隱藏深、作用期長、傷害不可逆等特點，這些特性會導致土壤缺乏營養物質，植株無法從土壤中獲取生長發育所需的成分[11]。對于植物而言，早在植株幼苗的生長發育時期，植株就表現出了對外界環境的適應能力，這個階段是植株適應外界環境的關鍵期，對植株自身的生長發育具有重要作用[12]。植物種子的萌發和早期生物量的變化情況就可以反映出酸雨和重金屬污染對其生長的影響，以往的研究顯示，超出植株適應范圍的重金屬會使植株幼苗的生長發育受到一定程度抑制。本研究中，低濃度的酸雨和鎘復合脅迫促進了黑麥草種子的萌發，而高濃度的復合脅迫明顯抑制了種子萌發，這與之前的一些研究結果“低促高抑”現象相同。然而，不同濃度酸雨和鎘復合脅迫均抑制了多年生黑麥草植株生長，高濃度酸雨和鎘脅迫（pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1）下黑麥草生物量顯著降低，這與代杰等對水芹耐Pb性的研究得出的結論一致，高濃度的重金屬脅迫會對水芹的生長發育產生明顯的抑制作用[13]。

葉綠素含量的變化對植物的光合作用有很大的影響，既可反映植物葉片光合作用功能的強弱，也可用以表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況。葉綠素降低會導致植物光合作用逐漸減弱，從而導致植物在此階段的生長受阻。本研究中，葉綠素含量與生物量的變化規律相似，即低濃度的復合脅迫促進了葉綠素的合成，而高濃度的復合脅迫顯著降低了葉綠素的含量，這與劉英杰等的研究結論類似[14]。有研究認為，不同品種作物葉片中的葉綠素含量隨重金屬濃度的升高呈現出先升高后下降的趨勢。這一研究也表明了酸和重金屬對植物葉綠素具有“低促進高抑制”影響[15]。推測造成本研究中這種變化趨勢的可能原因是：低濃度的酸和鎘處理提高了葉綠素酸酯還原酶的活性和氨基-γ-酮戊酸的含量[16]，使多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量逐漸增多；而高濃度的酸和鎘處理使鐵離子無法進入葉綠素，阻礙了合成葉綠素的有效途徑[17]。

植物細胞膜是細胞與環境的邊界，也是細胞與外界間進行物質運輸、能量交換和信息傳遞的重要場所。當植物遇到逆境時，細胞膜結構受到損傷，膜脂過氧化反應產生的高活性最終產物MDA持續破壞細胞質膜結構，致使電解質滲出引起組織浸泡液的電導率值發生變化。脅迫程度愈大，脂質過氧化程度越大，MDA 含量越高，相對電導率也就越高。本研究發現，高濃度酸和鎘復合脅迫顯著增加了多年生黑麥草幼苗葉片MDA含量和相對電導率。這與大多數已有的研究結果相似，各種非生物脅迫如干旱、酸雨、重金屬等都使植株的MDA含量和相對電導率顯著提高[15,18-19]。

通常膜脂過氧化還伴隨有活性氧產生，而植物體內的各種氧化酶就組成了一個有效的活性氧消除酶系統。POD 是一類活性較高的氧化還原酶，廣泛存在于植物細胞內，與植物的呼吸作用、光合作用等都有關系，尤其作為植物體內消除自由基傷害防護酶系成員之一，與植物的抗逆境能力密切相關。本試驗研究結果顯示，隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草植株體內POD 活性逐漸下降，在高鎘脅迫下，下降尤為明顯，這與孫天國等在毛尖紫萼蘚和楊盛昌等在桐花樹上的研究結果相同[20-21]。可能是因為隨著脅迫的加劇，多年生黑麥草體內產生了大量的過氧化物，而POD 的消除能力有限，使細胞受到傷害，致使POD活性下降。

3.2 結論

綜上所述，低濃度的酸雨和鎘復合脅迫促進了多年生黑麥草種子的萌發和幼苗葉綠素的合成，而高濃度的酸雨和鎘復合脅迫顯著抑制了多年生黑麥草種子的萌發和植株的生長，明顯降低了幼苗生物量和葉綠素含量，表現出一定的“低促高抑”現象。為了適應逆境，黑麥草幼苗植株POD 酶活性隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇而明顯降低，而MDA含量和相對電導率則顯著增加。