基于外泌體miRNA探討針刺“內迎香”穴治療變應性鼻炎的作用機制

丁 然,劉 真,王 金,夏 彤,李 蕾

中國中醫科學院西苑醫院,北京 100091

變應性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是一種鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病,以陣發性噴嚏、鼻塞、鼻癢與流清涕為主要癥狀,易誘發支氣管哮喘、變應性結膜炎、鼻竇炎及睡眠呼吸障礙綜合征等疾病[1],影響著全世界10%～40%的人口[2],已成為全球性健康問題。鼻內針刺內迎香穴作為臨床應用的特色治療,相較于傳統針刺方式,可直接作用于鼻黏膜,有效緩解AR的相關癥狀[3],但鼻內針刺內迎香穴治療AR的效應機制尚不明確,仍需進一步研究。近年來的研究顯示[4],外泌體miRNA參與AR的發病進程并可能成為AR潛在的生物標志物,對深入闡釋AR的發病機制及探索AR的診斷治療具有重要意義。同時,有研究發現,針刺可能通過外泌體miRNA發揮治療作用[5]。基于此,推測針刺內迎香穴可能通過影響外泌體miRNA的傳遞和釋放,以促進細胞間的物質交換與信息傳遞,從而起到治療AR的作用。因此,本研究以針刺內迎香穴影響外泌體miRNA的角度探討針刺治療AR的免疫調節機制,以期進一步豐富針刺作用的機理,為AR的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級SD健康雄性大白鼠30只,鼠齡為8～10周,體質量(200±20)g,購于北京斯貝福生物技術有限公司[動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0010]。于中國中醫科學院西苑醫院SPF級動物房分籠飼養,溫度(20±2)℃,相對濕度(40～60)%,12 h/12 h明暗周期,自由飲食飲水。適應性飼養 1 周后,將大鼠隨機分為空白組(Ko)、模型組(Mu)和針刺組(Zh),每組各10只。實驗過程嚴格遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》中對動物處理的相關規定,并得到中國中醫科學院西苑醫院動物實驗倫理委員會的批準(批準號:2022XLC007-3)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 卵清蛋白(美國Sigma);Al(OH)3(上海麥克林);Harris蘇木素(廣東BASO);伊紅染液(廣東BASO)。

1.2.2 儀器 一次性針灸針(0.18 mm×13 mm,蘇州華成);全自動輪轉切片工作站(德國Leica);全自動多功能染色蓋片一體機(德國Leica);正置顯微鏡(德國Zeiss),超速離心機(日本Hitachi);透射電鏡(日本Hitachi);粒徑分析儀(廈門NanoFCM);miRNeasy Mini kit(德國Qiagen);納米光度計分光光度計?(美國加利福尼亞州因普倫);Qubit?RNA檢測試劑盒(美國加利福尼亞州生命科技公司);RNA納米6000檢測試劑盒(美國加利福尼亞州安捷倫科技公司)。

1.3 模型制備

模型組和針刺組采用卵清蛋白腹腔注射及鼻黏膜刺激法建立變應性鼻炎大鼠模型[6]。基礎致敏:以卵清蛋白(OVA)0.3 mg、Al(OH)330 mg為佐劑及生理鹽水1 mL混合后制成混懸液腹腔注射,1次/2 d,共7次。激發致敏:基礎致敏結束后當天予5% 0VA生理鹽水滴鼻,每側鼻腔各10 vL,1次/d,連續7次。維持致敏:干預期間每天激發致敏,連續3周。空白組予等量生理鹽水腹腔注射及滴鼻。末次滴鼻結束30 min后觀察大鼠搔鼻、噴嚏和鼻溢等行為,各項指標均采用疊加量化記分法,癥狀積分總分>5分表示造模成功。鼻部癥狀評分標準[7]:①鼻癢:輕度搔癢1～2次為1分,劇烈瘙癢抓鼻四周2分;②噴嚏:1～3個為1分,4～10個為2分,10個以上為3分;③清涕:流至鼻孔為1分,超出前鼻孔為2分,涕流滿面為3分。

1.4 干預方法及取材

針刺組于激發致敏結束后予鼻內針刺雙側內迎香穴。參考文獻所述方法取穴[8],將大鼠俯臥位固定,針刺兩側鼻腔內迎香穴(位于大鼠下鼻甲前端附著區距鼻閾0.5 cm處),向鼻翼方向約15°進針,深度約黏膜下5 mm;針具采用塑柄針,0.18 mm×13 mm,不采用特殊手法,留針15 min,每周2次,連續3周。

末次干預結束后第4天,所有大鼠采用0.3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉,麻醉起效后使用抗凝管采集腹主動脈血2 mL,分離血漿于-80℃冰箱保存。迅速剝除大鼠上頜骨皮膚,游離出上頜骨,沿大鼠鼻中線剪開雙側鼻腔,使鼻中隔充分暴露,剝離鼻中隔黏膜,放入4%多聚甲醛中固定24 h后常規脫水、石蠟包埋制作切片(厚度為5 μm)。

1.5 HE染色觀察大鼠鼻黏膜組織形態變化

制備好的石蠟切片脫蠟至水,Harris蘇木素染色,5 min后入自來水洗數遍,鹽酸酒精分化1 s,溫水中返藍數秒,后經室溫蒸餾水清洗1 s,醇溶性伊紅染液中40 s,水洗2 s,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。100倍光學顯微鏡下觀察大鼠鼻黏膜組織學形態。

1.6 外泌體分離提取及鑒定

采用超速離心法提取外泌體,37 ℃中速溶樣本,將樣本移動至一個新的離心管內,2 000×g,4 ℃,30 min離心,將上清液移至新的離心管中,10 000×g,4 ℃,45 min離心,以去除較大的囊泡。再取上清,經0.45 μm濾膜過濾,收集過濾液移至新的離心管中,超速轉子,4 ℃,100 000×g離心70 min,去除上清。用10 mL預冷的1×PBS重懸后,超速轉子,4 ℃,100 000×g離心70 min,去除上清。用100/150 μL預冷的1×PBS重懸,取10 μL電鏡,10 μL粒徑分析,40/60 μL加700 μL RNA裂解液,剩余外泌體于-80 ℃保存。吸取外泌體10 μL滴加于銅網上沉淀1 min,并用濾紙吸去浮液,將醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網上沉淀1 min,濾紙吸去浮液,常溫干燥數分鐘,100 kv進行電鏡檢測成像,通過透射電鏡觀察外泌體的形態。將外泌體取出10 μL稀釋到30 μL。通過粒徑分析儀檢測外泌體的粒徑和濃度信息。

1.7 外泌體miRNA篩選

將總RNA裂解液解凍后,室溫下放置5 min,加入140 μL氯仿,渦旋混勻15 s。室溫下孵育3 min后4 ℃、12 000 g、離心15 min。上層水相轉移至一新的EP管中,加入1.5倍體積的無水乙醇,槍吸混勻。吸取700 μL混合液,轉移至RNeasy吸附柱中,室溫下8 000 g離心15 s,棄濾液,剩余混合液重復該步驟。添加700 μL Buffer RWT洗滌吸附柱,室溫下8 000 g離心15 s,棄濾液。添加500 μL Buffer RPE洗滌吸附柱,室溫下8 000 g離心15 s,棄濾液。添加500 μL Buffer RPE洗滌吸附柱,室溫下8 000 g離心2 min,棄濾液和收集管。將吸附柱轉移至新的2 mL新離心管中,12 000 g離心1 min進行干燥,棄濾液和收集管。將吸附柱轉移至1.5 mL新離心管,添加30 μL RNase-free water到吸附膜中間,8 000 g離心1 min,洗脫RNA。在1%瓊脂糖凝膠上監測RNA降解和污染。納米光度計分光光度計檢查RNA純度,Qubit?RNA檢測試劑盒測量RNA濃度,Agilent Bioanalyzer 2100系統的RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA完整性。樣品檢測合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫,利用Small RNA的3′及5′端特殊結構(5′端有完整的磷酸基團,3′端有羥基),以total RNA為起始樣品,將Small RNA兩端加上接頭,反轉錄合成cDNA。隨后經過PCR擴增,PAGE膠電泳分離目標DNA片段,切膠回收得到cDNA文庫。文庫構建完成后,使用Qubit2.0進行初步定量,稀釋文庫至1 ng/μL,Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測,insert size符合預期后,Q-PCR對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>2 nM),以保證文庫質量。庫檢合格后,把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling,在Illumina Hiseq 2500/2000平臺上進行高通量測序。FastQ格式的原始數據首先通過自定義perl和python腳本進行處理,通過刪除包含 ploy-N、5′適配器污染物、無3′適配器或插入標簽、包含ploy A或T或G或C的讀取以及來自原始數據的低質量讀取來獲得干凈的數據。同時計算原始數據的Q20、Q30和GC含量,然后從干凈讀數中選擇21～22 nt長度進行所有下游分析。

1.8 miRNA表達水平及差異分析

使用TPM計算各樣品miRNA的表達量,pearson相關系數的平方表示樣品間基因表達水平相關性,檢驗實驗可靠性及合理性。使用基于負二項分布的DESeq2軟件進行分析,以顯著水平P<0.05為差異miRNA的篩選條件,其中|log2(Fold Change)|>1。

1.9 靶基因預測及富集分析

采取miRanda和Targetscan兩個數據庫預測的交集作為針刺作用關鍵miRNA的靶基因。GO分析采用Gene Ontology(GO,http://www.geneontology.org/)數據庫和GOseq分析軟件以揭示其生物學功能。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析以KEGG Pathway為單位,應用超幾何檢驗,找出針刺作用關鍵miRNA的靶基因中顯著富集的Pathway,從而確定其參與的最主要信號轉導途徑和生化代謝途徑。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠鼻部癥狀評分

各組大鼠鼻部癥狀評分顯示,模型組大鼠的鼻部癥狀評分顯著高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05),表示造模成功。與模型組比較,針刺組的鼻部癥狀評分顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),說明鼻內針刺內迎香穴能顯著減輕變應性鼻炎大鼠的鼻部癥狀。見表1。

表1 各組大鼠鼻部癥狀評分

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織形態學變化比較

HE染色結果顯示,空白組鼻黏膜結構良好,排列整齊,形態正常,無明顯炎性細胞浸潤;模型組出現慢性炎癥,黏膜上皮細胞排列紊亂,可見黏膜水腫,部分區域有變性脫落,且炎性細胞明顯浸潤,證明變應性鼻炎大鼠造模成功;針刺組鼻黏膜可見黏膜上皮細胞輕度變性脫落,少量炎性細胞聚集, 無明顯水腫、血管擴張的改變。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織形態學比較(HE染色,100 μm)

2.3 血漿外泌體的鑒定

透射電鏡觀察顯示各組大鼠血漿中均有外泌體存在,呈茶托狀連續雙層膜囊泡結構。見圖2。納米粒徑分析結果顯示,樣品由直徑正態分布的異質性囊泡組成。見圖3。

圖2 各組大鼠血漿外泌體形態結構比較(標尺:100 nm)

圖3 各組大鼠血漿外泌體粒徑分布圖

2.4 空白組與模型組差異表達的miRNA

將空白組與模型組進行分析,共有16個差異表達的miRNA[P<0.05,|log2(Fold Change)|>1],其中模型組相對于空白組有6個上調、10個下調。見表2。空白組與模型組差異miRNA表達火山圖。見圖4。

圖4 空白組與模型組差異表達miRNA火山圖

表2 空白組與模型組差異表達的外泌體miRNA

2.5 針刺組與模型組差異表達的miRNA

將針刺組與模型組進行分析,共有52個差異表達的miRNA[P<0.05,|log2(Fold Change)|>1],其中針刺組相對于模型組有32個上調、20個下調。見表3。針刺組與模型組差異miRNA表達火山圖。見圖5。

圖5 針刺組與模型組差異表達miRNA火山圖

表3 針刺組與模型組差異表達的外泌體miRNA

2.6 針刺作用關鍵 miRNA 篩選及靶基因預測

為進一步篩選出針刺作用的關鍵 miRNA,將模型組相對于空白組上調的miRNA與針刺組較模型組下調的miRNA作韋恩圖取交集,得到5個miRNA:rno-miR-92a-3p、rno-let-7d-3p、rno-miR-328a-3p、rno-miR-223-3p及rno-miR-23a-3p;同時,將模型組相對于空白組下調的miRNA與針刺組較模型組上調的miRNA作韋恩圖取交集,得到5個miRNA:rno-miR-451-5p、novel_314、rno-miR-144-5p、rno-miR-23b-3p及rno-miR-144-3p。綜上,共篩選10個針刺作用關鍵miRNA:rno-miR-92a-3p、rno-let-7d-3p、rno-miR-328a-3p、rno-miR-223-3p、rno-miR-23a-3p、rno-miR-451-5p、novel_314、rno-miR-144-5p、rno-miR-23b-3p及rno-miR-144-3p。見圖6。采取miRanda和Targetscan兩個數據庫的交集來預測針刺作用關鍵miRNA的靶基因,建立miRNA-靶基因的聯系。10個差異miRNA共預測出7408個靶基因,針刺作用關鍵miRNA及靶基因個數見表4。

圖6 針刺作用關鍵miRNA的篩選韋恩圖

表4 針刺作用關鍵miRNA及其靶基因個數

2.7 靶基因生物信息學分析

對預測靶基因進行GO分析,其中涉及1 130個生物過程、158個細胞組分和166個分子功能。根據富集度進行排序,統計被顯著富集的各個GO term中的基因數,以柱狀圖的形式展示。見圖7。預測出的 miRNA 靶基因的生物學過程(Biological process,BP)分類顯示,其可能參與代謝過程的調節、發展過程和細胞代謝過程的調節等。細胞組分(Cellular component,CC)分類分析,發現其具有細胞內、細胞器、膜結合細胞器、細胞質和細胞核等細胞成分。分子功能(Molecu-lar function,MF)分類分析,發現其具有蛋白質結合等分子功能。

圖7 針刺作用關鍵miRNA靶基因GO功能分析

靶基因KEGG富集分析以P<0.05作為顯著富集通路的篩選標準,共篩出31條通路,根據P值排名前20的通路以Q-value、差異表達(rich factor)和涉及的靶基因數目作散點圖。見圖8。主要涉及胰腺癌、非小細胞肺癌等癌癥相關的信號通路,軸突引導、黏著連接、肌動蛋白細胞骨架的調節和細胞內吞作用等生物學過程,MAPK、Hippo、AMPK、FoxO、Rap1、神經營養因子、胰島素和Wnt等信號通路。

圖8 針刺作用關鍵miRNA靶基因KEGG通路富集分析

3 討論

鼻內針刺內迎香穴是臨床治療AR的特色療法,內迎香穴屬經外奇穴,最早記載見于《肘后備急方》。按《玉龍經》所載其穴“在鼻孔內上端”, 即鼻孔的內上端,與迎香穴隔鼻翼相對,在鼻翼軟骨與鼻甲交界處的黏膜上[9]。內迎香穴近鼻根,外應目內眥,足太陽膀胱經始于目內眥,與各臟腑背俞穴密切相連,針刺內迎香穴可調理臟腑氣機,具有行氣活血、散瘀瀉熱和宣通鼻竅之功效[10]。現代醫學研究發現內迎香穴處分布有面動、靜脈的鼻背支和篩前神經的鼻外支,所處位置下鼻甲是AR發病的重要靶器官,也是變應原進入機體最先接觸的部位[11]。通過針刺內迎香穴,可使下鼻甲前端海綿組織中富含的周圍容量血管收縮,從而改善鼻的局部血液和淋巴循環, 使腫脹的下鼻甲收縮, 進而擴大鼻腔容積,改善鼻腔通氣,緩解患者的鼻塞癥狀,也可一定程度上降低鼻部敏感性,緩解鼻癢、噴嚏等過敏癥狀[12]。

隨著AR發病機制的深入研究,近年來外泌體miRNA在AR發病中的作用受到廣泛關注。外泌體是細胞外囊泡的一種,直徑約為30～150 nm,是細胞質膜向內出芽形成的多囊體與細胞膜融合后釋放到細胞外形成的雙層囊泡狀結構[13-14]。其表面穩定的磷脂雙分子層結構可保護其內的蛋白質、核酸(如miRNA、mRNA)等免受酶的分解,從而介導細胞間的物質運輸與信息傳遞,將細胞內容物運輸入靶細胞,特異性調控靶細胞的生理和病理活動,參與疾病的進程[15-16]。作為細胞間的通訊工具,外泌體可以通過抗原呈遞以及促炎和抗炎介質的轉移參與免疫調控和炎癥的發展[17-18],減輕或加劇過敏反應[19]。MicroRNA(miRNA)作為外泌體攜帶的長度約為22 nt的內源性非編碼RNA,通過特異性結合靶mRNA的3′端非翻譯區(3′UTR)來調控轉錄后的基因表達,從而誘導靶mRNA降解或抑制蛋白質的翻譯[20-21],并參與細胞的增殖、分化、凋亡[22]和免疫反應[23]。近年來,miRNA被認為是變應性鼻炎的生物標志物和治療靶點[24],為變應性鼻炎的早期診斷和治療預后提供了可能。有研究顯示幼稚骨髓衍生的巨噬細胞的外泌體可通過攜帶miRNA靶向調節NF-kB和TNF-α信號傳導來抑制炎癥的產生[25]。人間充質干細胞的外泌體通過調節miR-146a-5p/SERPINB2途徑抑制Th2細胞分化,從而抑制變應性鼻炎的發展[26]。

本研究基于miRNA組學技術,目的為探討針刺內迎香穴治療AR大鼠的作用機制,通過對比發現,針刺作用關鍵miRNA有10個。本研究為探討針刺作用關鍵miRNA對AR模型大鼠的影響,對預測出的針刺作用關鍵miRNA靶基因進行KEGG通路富集分析,共得到31條通路。其中可能與AR相關的通路有MAPK信號通路(P=0.002<0.05)、Hippo信號通路(P=0.003<0.05)、AMPK信號通路(P=0.004<0.05)、FoxO信號通路(P=0.006<0.05)、Rap1信號通路(P=0.007<0.05)和Wnt信號通路(P=0.02<0.05)。而根據P值對所富集的通路排序后,除了腫瘤以外,MAPK是排在最前面的信號通路。因此推測,針刺關鍵作用外泌體miRNA分子可能通過影響MAPK信號通路進而影響AR疾病進展,發揮治療作用。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組真核生物中高度保守的能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[27]。MAPK通路主要由三級激酶級聯方式起效,包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK。這3種激酶能依次激活將細胞表面的信號傳導到細胞核內部引起細胞應答,再通過以下4條通路進行下游因子的激活:經典 MAPK(ERK)、C-Jun N 端激酶(JNK)、p38 MAPK和細胞外調節激酶5(ERK5),從而參與細胞的增殖、分化、凋亡及炎癥反應,是變應性鼻炎中重要的信號轉導通路[28]。其中,p38 MAPK 信號通路的激活可促進各種細胞因子和炎性介質的釋放,在免疫系統的調節中起著關鍵作用[29]。研究表明,p38 MAPK信號通路可調節MUC5AC的表達增高,從而導致AR中黏液過度分泌[30]。而p38 MAPK抑制劑均能減少黏膜下炎性細胞的浸潤以及減輕鼻黏膜過敏反應[31]。MAPK家族中的JNK信號通路與AR的發生及鼻黏膜組織的重塑密切相關[32]。

綜上,針刺內迎香穴可能通過調節外泌體miRNA介導MAPK信號通路從而抑制機體炎性反應,對AR起到治療作用。