電針對(duì)反復(fù)丙泊酚暴露大鼠炎癥反應(yīng)的影響

王喜軍,高 寧,范舜欽

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬?lài)?guó)際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200

丙泊酚作為一種靜脈麻醉藥,具有誘導(dǎo)時(shí)間短、起效快、恢復(fù)時(shí)間短和降低腦氧耗等[1]優(yōu)點(diǎn),是一種臨床常用的靜脈全麻藥物,通常用于小兒麻醉的誘導(dǎo)和維持,已經(jīng)在臨床工作中被廣泛使用。有研究表明,單次接觸丙泊酚麻醉對(duì)新生大鼠大腦神經(jīng)發(fā)育無(wú)明顯影響,且能夠緩解手術(shù)創(chuàng)傷所造成的幼鼠中樞炎癥反應(yīng)[2-3]。但反復(fù)接受丙泊酚麻醉可引起中樞炎癥介質(zhì)釋放增多,產(chǎn)生神經(jīng)炎癥反應(yīng),由此產(chǎn)生的神經(jīng)回路結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致神經(jīng)功能認(rèn)知障礙[4],術(shù)后對(duì)患者的生活造成不良影響。針灸“治未病”已有悠久的歷史,可激發(fā)人體內(nèi)的正氣,增強(qiáng)抗病能力,防止疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。電針是傳統(tǒng)針灸與現(xiàn)代電刺激相結(jié)合的產(chǎn)物,它是指在毫米針具上接通與人體生物電相似的脈沖電流,利用針、電雙重刺激,調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)之氣以達(dá)到防止疾病的目的[6]。2003年,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)重復(fù)電針刺激百會(huì)穴可以減輕腦缺血后神經(jīng)受損程度,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)[7]。目前已有研究表明,電針能夠降低腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)[8]。電針大椎、百會(huì)減輕神經(jīng)炎癥的效果明顯[9-10]。因此,本研究觀察電針干預(yù)對(duì)反復(fù)丙泊酚暴露大鼠炎癥反應(yīng)的影響,以期為臨床麻醉后的重要器官功能保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

10日齡健康SD大鼠40只(雌雄各半,體質(zhì)量26～28 g)購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK[桂]2014-0002)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于普通動(dòng)物房飼養(yǎng),溫度24 ℃,相對(duì)濕度60%～70%。每天8:00—20:00日光燈照明,模擬12 h/12 h的白晝比例。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的許可(審批號(hào):DW20230313-036)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 丙泊酚注射液(四川國(guó)瑞,批號(hào):22120212);兔抗IL-6(1:1 000,A0286,Servicebio,China);兔抗TNF-α(1:1000,A0277,Servicebio,China);兔抗β-actin(1:1000,GB11001,Servicebio,China);兔抗HMGB1(1:1000,GB11103,Servicebio,China);兔抗Iba-1(1:1 000,GB11105,Servicebio,China)。

1.2.2 儀器 一次性無(wú)菌針灸針(華佗牌);SDZ-Ⅱ華佗牌電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.3 分組與干預(yù)方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為5組(每組8只):生理鹽水對(duì)照(C)組,腹腔注射生理鹽水100 μL;脂肪乳劑(F)組,腹腔注射脂肪乳劑100 μL;電針(E)組,選取大鼠“百會(huì)穴”“大椎穴”進(jìn)行電針刺激;丙泊酚(P)組,腹腔注射異丙酚100 mg/kg;電針+丙泊酚(EP)組,先給予丙泊酚(同P組),后電針干預(yù)(同E組)。

1.3.1 電針?lè)椒?電針的穴位選取百會(huì)穴(頂骨正中、兩耳連線中點(diǎn)),大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間、背部正中);根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的大鼠穴位定位方法[11]進(jìn)行定位。將一次性無(wú)菌針灸針平刺入百會(huì)穴2 mm,斜刺入大椎穴3 mm,通過(guò)連接電針儀,疏密波,頻率2 Hz/10 Hz,刺激強(qiáng)度以大鼠針刺部位皮膚微顫為宜,1次/d,每次持續(xù)30 min,連續(xù)干預(yù)3 d。

1.3.2 反復(fù)丙泊酚暴露模型 首次腹腔注射丙泊酚50 mg/kg,待大鼠翻正反射恢復(fù)后,再追加丙泊酚50 mg/kg,連續(xù)給藥5 d。

1.4 取材

造模完成后進(jìn)行取材,對(duì)大鼠充分麻醉后,立即于冰面上斷頭取海馬組織。用冰的生理鹽水和冰的多聚甲醛溶液依次進(jìn)行灌流,腦組織充分固定后,用解剖器械鈍性剝離顱骨,快速取出整個(gè)腦組織于多聚甲醛溶液中固定備用。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 免疫熒光染色檢測(cè)海馬組織中Iba-1、HMGB1的表達(dá)量 將每組腦組織切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)等操作,隨后孵育一抗:封閉完成后,取出腦組織切片,倒去封閉液,將稀釋好的一抗工作液滴加在腦切片表面,置于濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜。孵育二抗:一抗孵育完畢后,充分清洗再滴加熒光二抗工作液于腦切片表面,放入濕盒內(nèi),置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。最后封片和觀察,每組選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照。

1.5.2 Western blot法檢測(cè)海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量 加入適量蛋白樣品和Marker,上樣完成后,設(shè)定90 V恒壓,開(kāi)始電泳,觀察到藍(lán)色蛋白樣品位于分離膠和濃縮膠交界位置,Marker分離成多條清晰的直線時(shí),調(diào)整電壓為120 V,繼續(xù)電泳,直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠下緣時(shí),可以終止電泳。轉(zhuǎn)膜:設(shè)置快轉(zhuǎn)電流為0.4 A,時(shí)間為15 min。封閉:快轉(zhuǎn)完畢后將PVDF膜取出,5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。孵一抗:封閉完畢后將PVDF膜用TBST溶液洗3次,每次10 min,然后浸泡在一抗工作液中,放在搖床均勻搖晃,4 ℃過(guò)夜。敷二抗:將孵育好一抗的PVDF膜取出,TBST洗3次,每次10 min,然后浸泡在二抗工作液中常溫孵育1 h。顯影與結(jié)果分析:利用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影,使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行結(jié)果分析,以β-actin為內(nèi)參,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為T(mén)NF-α、IL-6相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況比較

Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要標(biāo)志物。與C組比較,P組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1累積熒光強(qiáng)度明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯增多;丙泊酚注射液的主要成分是脂肪乳劑和2,6-二異丙基苯酚,故設(shè)脂肪乳劑組(F組)以排除脂肪乳劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。與C組比較,F組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1累積熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示丙泊酚注射液中的脂肪乳劑成分對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。與C組比較,E組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1累積熒光強(qiáng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示電針對(duì)健康新生大鼠海馬區(qū)無(wú)影響。與P組比較,EP組海馬Iba-1累積熒光強(qiáng)度下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示電針能抑制海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組新生大鼠海馬區(qū)Iba-1累積熒光強(qiáng)度比較

注:免疫熒光檢測(cè)各組海馬Iba-1表達(dá);紅色為Iba-1,A標(biāo)尺=100 μm,B標(biāo)尺=50 μm。圖1 電針對(duì)新生大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

2.2 各組海馬組織中HMGB1的表達(dá)情況比較

與C組比較,P組海馬區(qū)HMGB1累積熒光強(qiáng)度明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與P組比較,EP組海馬區(qū)HMGB1累積熒光強(qiáng)度下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示電針能抑制海馬區(qū)HMGB1的表達(dá)。C組與F組、E組的差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組新生大鼠海馬區(qū)HMGB1累積熒光強(qiáng)度比較

注:紅色為Iba-1,綠色為HMGB1, 藍(lán)色為DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。 圖2 電針對(duì)新生大鼠海馬區(qū)HMGB1表達(dá)的影響

2.3 各組海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量比較

與C組比較,P組海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與P組比較,EP組海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E組和EP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

表3 各組新生大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-6表達(dá)含量比較

圖3 電針對(duì)新生大鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

3 討論

中醫(yī)對(duì)“炎癥”并無(wú)明確的概念[12]。漢字“炎”是二火重疊,根據(jù)中醫(yī)理論中“取類(lèi)比象”“推絡(luò)演繹”的思維,火熱之性燔灼,一般將“炎癥”歸于熱證、實(shí)證病機(jī)范疇,通常治法為清熱瀉火,但臨床效果不佳。電針作為近年來(lái)新興的治療手段,在臨床上已有一定的效果。百會(huì)穴位于督脈,有通督調(diào)神、醒腦開(kāi)竅之效[13]。有研究表明[14-16],針刺百會(huì)、大椎穴能夠顯著降低腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)模型大鼠大腦的炎癥反應(yīng),保護(hù)腦功能。故本實(shí)驗(yàn)選取百會(huì)和大椎穴進(jìn)行電針干預(yù)。海馬組織對(duì)于炎癥反應(yīng)極為敏感[17],在研究丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的腦功能障礙中,研究者[18-19]一般通過(guò)海馬組織觀察中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

在實(shí)驗(yàn)大鼠日齡的選擇上,根據(jù)既往研究選擇10日齡SD大鼠作為研究對(duì)象[20-21]。嬰幼兒應(yīng)用麻醉藥物是否對(duì)發(fā)育期大腦產(chǎn)生影響一直是醫(yī)學(xué)界存在爭(zhēng)議的話題。Li Y等[22]的研究表明新生大鼠接受局麻手術(shù)和多次丙泊酚麻醉可在建模1 d后引起中樞炎癥介質(zhì)釋放增多,海馬組織中TNF-α濃度增加,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteine-containing aspartate-specific protease,Caspase)-3和原癌蛋白Fos(oncogene Fos,c-Fos)表達(dá)增多。

本研究顯示反復(fù)丙泊酚暴露在短期內(nèi)使新生大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)明顯升高,加重神經(jīng)炎癥反應(yīng),與Cui Y等[23]的研究結(jié)果一致,即長(zhǎng)時(shí)間、反復(fù)丙泊酚刺激可加重大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng),而電針干預(yù)后海馬組織中TNF-α、IL-6表達(dá)量較單純丙泊酚組(P組)明顯降低。既往臨床試驗(yàn)研究[24]也表明電針督脈穴能夠降低腦梗死恢復(fù)期患者炎癥因子TNF-α、IL-1β水平,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的主要標(biāo)志物,其表達(dá)量反映了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度[25]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞,主要生理功能包括免疫監(jiān)視、吞噬異常細(xì)胞,調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng),調(diào)節(jié)突觸可塑性[26]。同時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)π源碳ぷ龀龇磻?yīng)[27]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生創(chuàng)傷、缺血缺氧和神經(jīng)退行性改變等病理?yè)p傷時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)镸1、M2兩種活化類(lèi)型,M1型通過(guò)分泌蛋白酶、炎癥因子等加劇炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷移至受損區(qū)域,而M2型可分泌抗炎因子從而減輕炎癥反應(yīng)[28]。Deng P等[29]發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)能夠抑制腦缺血誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。劉欣媛等[30]的研究表明電針百會(huì)、腎俞穴能夠抑制7月齡SAMP8小鼠海馬的炎癥反應(yīng),減少炎癥因子的分泌,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,有腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,與造模組(P組)比較,電針處理組(EP組)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞中Iba-1水平降低,且炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)降低,提示電針可能通過(guò)下調(diào)Iba-1表達(dá)水平,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型活化,從而減輕反復(fù)丙泊酚暴露大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

HMGB1是一種典型的損傷相關(guān)分子模式蛋白[31],廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中,在大腦中由小膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)分泌或受損、死亡的細(xì)胞被動(dòng)分泌,作為細(xì)胞外信號(hào)分子促進(jìn)免疫細(xì)胞向病變部位遷移產(chǎn)生炎癥反應(yīng),調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥聯(lián)級(jí)反應(yīng)[32],同時(shí)也是細(xì)胞壞死性凋亡釋放的關(guān)鍵因子[33]。有研究表明[34]在術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)模型中,小鼠海馬細(xì)胞釋放的HMGB1可增加Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)2的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,反復(fù)丙泊酚暴露的新生大鼠通過(guò)電針干預(yù)后,海馬小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)水平降低,同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)量下降,提示電針減輕反復(fù)丙泊酚暴露神經(jīng)炎癥的部分機(jī)制可能是抑制小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)、減少小膠質(zhì)細(xì)胞壞死性凋亡的數(shù)量。

綜上所述,電針能有效抑制反復(fù)丙泊酚暴露大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞因子Iba-1、HMGB1的表達(dá)水平、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化和壞死性凋亡有關(guān)。