基于網絡藥理學研究玉屏風顆粒調節IgA腎病模型小鼠Th1/Th2平衡的作用機制*

李雅靜，杜 宇，白雅雯，王 爍，卜鳳躍，孫麗寧，邊春艷

（1.內蒙古醫科大學中醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.包頭市第八醫院，內蒙古 包頭 014040；3.包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古 包頭 014017；4.克什克騰旗蒙醫中醫醫院，內蒙古 赤峰 025378）

IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）是最常見的原發性腎小球疾病，低糖基化IgA1沉積于腎小球系膜區為其病理特征，血尿、蛋白尿、高血壓等為其主要臨床表現。相關統計發現，50%的IgAN患者在20～25年內可進展至終末期腎病（endstage renal disease，ESRD）[1]。IgAN的治療重點是優化支持治療，包括嚴格控制血壓、使用最大耐受劑量的腎素-血管緊張素系統抑制劑（renin-angiotensin system inhibitors，RASI）以及生活方式改變等來延緩疾病的進展[2]。

IgAN可歸屬于中醫學“血尿”“水腫”“腰痛”等范疇。病位雖然在腎，但與肺臟關系十分密切。《靈樞·本輸》云“腎上連肺”。肺主皮毛，外通玄府，上達咽喉。若肺主氣無權，無力抗邪，外邪侵襲，從表入里或由上傳下，皆可波及于腎；反之，若肺主氣有權，玄府開闔有度，外邪則無從侵襲，故有學者認為治腎病必先求之于肺。玉屏風散是補肺固表、扶正固本的經典方劑。臨床研究發現，玉屏風顆粒可提高腎病治療總有效率和治愈率，減輕激素對人體腎功能的損傷，消退浮腫，改善尿蛋白，防止IgAN患者因外感而加重或復發[3-8]。然而目前其作用機制研究較少，本研究擬通過網絡藥理學方法預測玉屏風顆粒治療IgAN的作用機制，并通過動物實驗進行驗證，闡述其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 篩查玉屏風顆粒有效成分和作用靶點 活性化合物的篩選條件為口服生物利用度（oral bioavail-ability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。在TCMSP數據庫（https://tcmsp-e.com/）[9]中檢索中藥標準化名稱“黃芪、白術、防風”的化學成分。獲取標準化名稱的有效成分，建立數據庫，運用SwissTarget（http://www.swisstargetprediction.ch/）對缺少的靶點化合物進行補充[10]。運用Uniport數據庫將其轉換為統一的基因名稱。

1.1.2 疾病靶點篩選 以“ IgA nephropathy”為關鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數據庫中，檢索IgAN靶點，進行合并去重，獲得最終靶點。

1.1.3 構建“活性成分-交集靶點-疾病”網絡圖 將獲得的玉屏風顆粒和IgAN的靶點分別導入Venny 2.1.0在線平臺取兩者交集靶點，繪制韋恩圖。運用Cytoscape3.7.2軟件構建“活性成分-交集靶點-疾病”網絡關系圖。

1.1.4 構建蛋白互作網絡圖 運用String數據庫（https://cn.string-db.org/）[11]，構建蛋白互作網絡（PPI），通過Cytoscape 3.7.2軟件獲取核心靶點。

1.1.5 富集分析 運用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）并設置閾值＜0.05，進行GO功能和KEGG富集分析，利用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）制作GO和KEGG富集氣泡圖。

1.2 分子對接 通過PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲得核心靶蛋白3D結構PDB格式文件，去除配體和水分子。通過PubChem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得玉屏風顆粒主要活性成分3D結構文件，經Auto Dock Tool軟件預處理后，運用Auto Dock Vina1.5.6軟件進行分子對接。

1.3 動物實驗 選取SPF級雄性昆明小鼠60只，體質量20~22 g，購買并飼養于內蒙古醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（蒙）2020-0001。飼養環境：室溫20~24 ℃，相對濕度40%左右，12 h光照環境。所有小鼠均經尿蛋白試紙測試為陰性，適應性飼養7 d開始造模，動物實驗經內蒙古醫科大學倫理委員會批準（倫理審批號：YKD2014001）。

1.3.1 藥物與試劑 24小時尿蛋白定量（24-hour urine protein，24 h-UTP）試劑盒（批號：CS8480）、血肌酐（serum creatinine，Scr）試劑盒（批號：CR6113）、尿素氮（serum urea nitrogen，SUN）試劑盒（批號：BU8121）均購自北京利德曼生化股份有限公司；脂多糖（批號：L8880）、牛血清白蛋白（批號：A8020）均購自美國sigma公司；蘇木素（批號：G1140）、伊紅（批號：G1100）、糖原染色液（批號：G1280）均購自北京索萊寶科技有限公司；熒光素標記的兔抗大鼠IgA抗體（批號：SC-373823）購自Santa Cruz Biotechnology；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號：JYM0218Mo）、干擾素γ（interferon-gamma，INF-γ）試劑盒（批號：JYM0540Mo）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）試劑盒（批號：JYM0010Mo）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號：JYM0012Mo）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）試劑盒（批號：JYM0011Mo）均購自武漢基因美生物科技有限公司。黃芪（批號：22002351）、白術（批號：22042181）、防風（批號：21029071）按比例（3：1：1）購自天津康仁堂藥物有限責任公司；福辛普利鈉片（國藥準字號H19980197）購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.3.2 主要儀器 TBA-40FR全自動生化分析儀（北京利德曼生化股份有限公司）；FlexA-200酶標定量測定儀（合肥吉象生物技術有限公司）；KS41SF光學顯微鏡、NIKON ECLIPSE CI正置熒光顯微鏡（日本尼康）。

1.3.3 造模方法 60只SPF級雄性昆明小鼠，隨機分為正常組10只，造模組50只。參照湯穎等[12-14]改進的“口服牛血清白蛋白（BSA）+尾靜脈注射脂多糖（LPS）+皮下注射四氯化碳（CCl4）”建立IgAN小鼠實驗模型，造模組大鼠采用0.1%BSA酸化水灌胃，劑量為0.4 mL/只，隔日1次；每周1次皮下注射體積分數為25%的CCl4溶液，0.4 mL/只。第6周、第8周尾靜脈注射0.05mgLPS。正常組給予等量6 mmol/L酸化水、蓖麻油、生理鹽水分別進行灌胃、皮下注射、尾靜脈注射，持續到第8周末。8周末隨機選取正常組和造模組小鼠各1只進行IgA免疫熒光染色以確定造模是否成功。

1.3.4 分組及給藥 將49只造模成功小鼠隨機分為模型組（9只）、西藥對照組（10只）、玉屏風顆粒高劑量組（10只）、玉屏風顆粒中劑量組（10只）、玉屏風顆粒低劑量組（10只），給藥劑量參考玉屏風顆粒及福辛普利鈉片使用說明書分別為15 g/d、10 mg/d，按照體表面積換算法計算，玉屏風顆粒高劑量組劑量為78 mg/d，玉屏風顆粒中劑量組劑量為39 mg/d，玉屏風顆粒低劑量組劑量為19.5 mg/d，西藥對照組給予福辛普利鈉片（0.026 mg/d），模型組及正常組給予4 mL蒸餾水，給藥8周。

1.3.5 觀察指標

1.3.5.1 一般情況 觀察、測量并記錄小鼠的一般情況，包括尿量、尿液的顏色及體質量。

1.3.5.2 血液指標 給藥結束后，小鼠采用異氟烷吸入性麻醉，沿腹正中線剪開，鈍性逐層分離腹主動脈，使用一次性采血針采集小鼠腹主動脈血液，靜置2 h，3 500 r/min（離心半徑為4 cm），離心10 min，分離血清。ELISA法檢測腎功能（24 h-UTP、BUN、Scr），血清中IgA、輔助性T細胞因子1（T helper cell 1，Th1）相關因子TNF-α、INF-γ、IL-2，以及輔助性T細胞因子2（T helper cell 2，Th2）相關因子IL-6、IL-4表達水平。

1.3.5.3 腎組織病理學變化 取腎臟，去除包膜，置于4%多聚甲醛組織液中固定48 h，流水沖洗24 h，常規脫水，石蠟包埋，制作成3 μm厚切片，用于IgA免疫熒光染色、HE染色、糖原染色，分別置于熒光顯微鏡、光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化，拍照記錄。

2 結果

2.1 網絡藥理學結果

2.1.1 玉屏風顆粒-IgAN交集靶點 通過TCMSP數據庫，去重后得到玉屏風顆粒活性成分34個，作用靶點222個。通過GeneCards、OMIM、TTD數據庫檢索，刪除重復后得到疾病靶點1 436個，輸入Venny2.1.0在線平臺，獲得交集靶點102個，繪制韋恩圖。（見圖1）

圖1 韋恩圖

2.1.2 “活性成分-交集靶點-疾病”網絡模型 使用Cytoscape3.7.2繪制“活性成分-交集靶點-疾病”相互作用網絡圖，網絡中有140個節點，478條邊。（見圖2）通過拓撲學分析，度值排名靠前10的化合物有槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）等。（見表1）通過String數據庫構建蛋白互作網絡圖，使用Cytoscape3.7.2軟件，根據度值構建核心靶點網絡圖，其中平均度值為37.54，最大值為83，最小值為1，大于平均度值靶點有51個，排名靠前的有TNF、IL-6、IL-4、IL-2等。（見圖3、表2）

表1 核心化合物

表2 核心靶點

圖2 活性成分-交集靶點-疾病網絡圖

圖3 核心靶點網絡圖

2.1.3 富集分析 通過DAVID數據庫對交集靶點進行GO富集分析，以P＜0.05為篩選條件，得到生物過程（BP）689條、細胞組分（CC）54條、分子功能（MF）115條，分別選取排名前10的結果繪制GO富集氣泡圖。（見圖4）通過DAVID數據庫進行KEGG富集分析，得到157條信號通路，選取最具代表性的前20條通路，作KEGG富集氣泡圖。（見圖5）

圖4 GO 富集氣泡圖

圖5 KEGG 富集氣泡圖

2.2 分子對接結果 分子對接結果顯示，主要化合物與關鍵靶點均有較好的結合活性，所有結合能均≤-6.0 kJ/mol。（見圖6）結合作用最強的是槲皮素與IL-6，結合能為-10.4 kJ/mol。（見圖7）其次是槲皮素與TNF，結合能為-9.3 kJ/mol。（見圖8）

圖6 分子對接熱圖

圖7 槲皮素-IL-6

圖8 槲皮素-TNF

2.3 動物實驗結果

2.3.1 各組小鼠一般情況 造模8周后，造模組小鼠食欲差，體質量偏低，皮毛蓬垢，喜臥惡動，尿色深，尿味重；給藥后，各治療組小鼠一般狀況均有不同程度改善。

2.3.2 各組小鼠腎組織IgA免疫熒光染色結果 正常組小鼠腎小球系膜區可見極少IgA沉積；模型組、西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組均可見不同強度綠色熒光信號。其中模型組可見團塊狀強綠色熒光信號；西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組熒光信號強度較模型組明顯降低，呈散在顆粒狀，其中玉屏風顆粒高劑量組降低程度最明顯。（見圖9）

圖9 各組小鼠腎組織IgA 免疫熒光染色病理圖（免疫熒光染色，×200）

2.3.3 各組小鼠腎組織HE染色結果 正常組小鼠腎小球結構正常，腎小球系膜細胞、系膜基質未見增生，無纖維組織增生；模型組小鼠可見腎小球腫脹，系膜細胞和內皮細胞增生，細胞外基質增多，系膜區擴張。與模型組比較，西藥對照組及玉屏風顆粒組高、中、低劑量組小鼠腎組織病變程度均有所改善，其中玉屏風顆粒高劑量組改善較為明顯。（見圖10）

圖10 各組小鼠腎組織HE 染色病理圖 （HE 染色，×300）

2.3.4 各組小鼠腎組織PAS染色結果 正常組小鼠腎組織未見系膜細胞增生，細胞外基質增多；模型組小鼠腎組織可見中重度系膜細胞增生及細胞外基質增多，同時見間質炎癥細胞浸潤；西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組可見系膜細胞增生程度均有所減輕，細胞外基質以輕中度增生為主，其中以玉屏風顆粒高劑量組減輕較為明顯。（見圖11）

圖11 各組小鼠腎組織PAS 染色病理圖（PAS 深色，×400）

2.3.5 各組小鼠腎功能比較 與正常組比較，模型組小鼠24 h-UTP及血清中BUN、Scr水平明顯升高（P＜0.01）；給藥后，各治療組小鼠腎功能均有不同程度改善，但不同干預藥物及玉屏風顆粒組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠腎功能比較 （±s）

表3 各組小鼠腎功能比較 （±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

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2.3.6 各組小鼠血清中IgA、Th1/Th2比較 與正常組比較，模型組小鼠血清中IgA含量明顯升高（P＜0.05），使用藥物治療后，各治療組小鼠血清中IgA含量均有所下降。其中，西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組明顯低于模型組（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒中、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒高劑量組與玉屏風顆粒中、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒中、低劑量組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血清中Th1相關因子TNF-α、INF-γ、IL-2表達水平明顯降低（P＜0.05），使用藥物治療后，各治療組小鼠血清中Th1相關因子TNF-α、INF-γ、IL-2均有所上調；西藥對照組小鼠血清中TNF-α表達與玉屏風顆粒高、中、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒高劑量組與玉屏風顆粒低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組小鼠血清中INF-γ與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高、中、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。西藥對照組及玉屏風顆粒高、中劑量組小鼠血清中IL-2與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與玉屏風顆粒中劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒高、中劑量組組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組小鼠血清中Th2相關因子IL-4、IL-6表達水平明顯升高（P＜0.05）；使用藥物治療后，各治療組小鼠血清中Th2相關因子IL-4、IL-6表達水平均有所降低；西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組小鼠血清中IL-4與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高、中劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與玉屏風顆粒低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；玉屏風顆粒高劑量組與玉屏風顆粒低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，西藥對照組及玉屏風顆粒高、中、低劑量組血清中IL-6均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高、中劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與玉屏風顆粒低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒高劑量組與玉屏風顆粒低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血清Th1/Th2（INF-γ/IL-6）比值明顯降低（P＜0.05）；使用藥物治療后，各治療組小鼠血清中Th1/Th2（INF-γ/IL-6）比值明顯升高（P＜0.05）；西藥對照組與玉屏風顆粒高、中、低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；玉屏風顆粒高、中、低劑量組組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠血清中IgA、Th1 相關因子、Th2 相關因子、Th1/Th2 比較 （±s）

表4 各組小鼠血清中IgA、Th1 相關因子、Th2 相關因子、Th1/Th2 比較 （±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥對照組比較，cP＜0.05；與玉屏風顆粒高劑量組比較，dP＜0.05；與玉屏風顆粒中劑量組比較，eP＜0.05；與玉屏風顆粒低劑量組比較，fP＜0.05。

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3 討論

《諸病源候論》指出“風邪入于少陰，則尿血，是為風邪擾腎也”；《傷寒雜病論》記載“風為百病之長，中于項，則下太陽，甚則入腎”，說明風邪是IgAN的主要致病因素。周靜威等[15]認為腎臟病的發生根于外風傷腎、內風動腎、風伏腎絡、內外合風。郭立中在治療腎炎尿蛋白時常用祛風、息風、搜風、御風等法[15]。《黃帝內經》云“風水相搏……，金為水母，母病及子，肺腎同病，而成風水是也”。這說明本病病位雖然在腎，但與肺臟關系密切。《素問·咳論篇》云“皮毛者，肺之合也”。肺通過宣散功能將衛氣布散于皮毛，成為抵御外邪的第一道防線，如《醫旨緒余·宗氣營氣衛氣》所言，“衛氣者，為言護衛周身……不使外邪侵犯也”。風邪侵襲，衛氣奮起反抗，與邪氣相互交爭于肌表。肺氣失于宣降，水液代謝障礙，壅塞于肌表而見水腫；若肺衛功能異常，無力抗邪，風邪循經入里，下移至腎，擾動腎臟，則見血尿；腎失封藏，精微物質外泄，則見蛋白尿。《素問·評熱病論篇》云“邪之所湊，其氣必虛”，故本病是肺衛虧虛，無力抗邪所致。玉屏風散是補肺固表、扶正固本的經典方劑，由黃芪、白術、防風組合而成。方中黃芪與白術君臣合用，補氣固表，扶正固本，鞏固人體的根本，防止體內精微物質外泄，以降低蛋白尿、減少血尿、保護腎功能，促進受損腎組織修復。黃芪得防風，固表而不留邪；防風得黃芪，祛邪不傷正。全方補中寓疏，散中寓補，重在提升人體的正氣，鞏固人體的根本，改善機體病理狀態，恢復其生理功能，改善IgAN患者的臨床癥狀，延緩病情的進展。黃芪具有雙向調節免疫的作用，可改善腎臟微循環，提高腎小球濾過率，延緩腎纖維化，恢復腎小管重吸收與分泌功能，保護腎功能[6,16-18]。

現代醫學研究發現，T淋巴細胞在腎臟病中具有免疫調節、免疫激活、免疫耐受的重要作用，尤其是CD4+T淋巴細胞在原發性腎小球疾病中的作用受到越來越多的國內外學者的關注[19]。活化的CD4+T細胞可以由Th0細胞分化Th1、Th2細胞。Th1細胞主要分泌INF-γ、TNF-α、IL-2等細胞因子參與細胞免疫，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6等細胞因子參與體液免疫[20-21]。INF-γ、IL-6作為Th1、Th2細胞分泌合成的特征性細胞因子[22]，兩者的比值即INF-γ/IL-6可反映Th1/Th2平衡狀態。當機體免疫功能異常時，Th1/Th2則處于失衡狀態[23]。研究發現，Th1/Th2失衡與IgAN的臨床表現、病理分級顯著相關，主要表現為Th1及其分泌的INF-γ、TNF-α、IL-2等細胞因子減少，細胞免疫受抑制，致使體內病原體不能及時清除，病原體反復持續刺激B細胞增殖產生IgA入血；Th2失去Th1制約，使Th0細胞向著Th2細胞方向極化，增多的Th2及其分泌的細胞因子IL-4、IL-6等進一步刺激B細胞增殖、活化，進而產生更多的IgA入血，加之半乳糖基化缺陷使得IgA糖基化異常，產生的Gd-IgA1沉積于腎小球系膜區導致IgAN的發生[24]。

本次網絡藥理學共篩選出玉屏風顆粒治療IgAN的關鍵靶點有TNF、IL-6、IL-4、IL-2等。分子對接結果表明，槲皮素與TNF、IL-6、IL-4、IL-2具有較好的結合活性，這也體現出中藥治療的多靶點特點。本次動物實驗表明，與正常組比較，模型組小鼠血清中Th1相關因子TNF-α、INF-γ、IL-2減少，Th2相關因子IL-4、IL-6增多，這說明IgAN模型小鼠中存在Th1/Th2失衡，向Th2漂移，同時伴血清IgA高表達。這與以往的研究結果一致。給予藥物干預后，與模型組比較，玉屏風顆粒可下調Th2相關因子及IgA的表達水平，上調Th1相關因子，糾正Th1/Th2失衡，改善腎功能和腎臟組織病理學。該作用以玉屏風顆粒高劑量組作用最為明顯。

綜上所述，玉屏風顆粒治療IgAN的機制可能是通過主要活性成分槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等作用于TNF、IL-6、IL-4、IL-2等靶點來實現的。玉屏風顆粒對IgAN具有較好的治療作用，其機制可能是通過調節Th1/Th2失衡，減輕體內免疫炎癥反應，從而改善腎功能和腎臟組織病理情況。