HPLC多指標(biāo)成分聯(lián)合PCA、OPLS-DA及灰色關(guān)聯(lián)度法的宮瘤消膠囊綜合質(zhì)量評價*

張希冉，貢磊磊，李軼凡，秦春雨，王志軍

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院，北京 100026；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200）

宮瘤消膠囊（GLX）由黨參、白花蛇舌草、牡丹皮、香附和莪術(shù)等中藥經(jīng)滲漉等加工工藝制備而成，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-11329（ZD-1329）-2002-2011Z[1]。GLX具有活血化瘀、軟堅散結(jié)之功效，用于子宮肌瘤屬氣滯血瘀證，證見：月經(jīng)量多，夾有大小血塊，經(jīng)期延長，或有腹痛，舌暗紅，或邊有紫點(diǎn)、瘀斑，脈細(xì)弦或細(xì)澀。目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]僅以單一成分為定量指標(biāo)，不能滿足中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要，更不能保證產(chǎn)品質(zhì)量及臨床療效?；瘜W(xué)計量學(xué)[4-5]方法可通過對多成分的定量測定結(jié)果進(jìn)行提取和降維，挖掘復(fù)雜數(shù)據(jù)間存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)關(guān)系，找出對質(zhì)量控制具有顯著貢獻(xiàn)的主要成分?；疑P(guān)聯(lián)度分析（GRA）法[6]基于灰色系統(tǒng)的灰色過程，根據(jù)各因素數(shù)列曲線形狀相似程度進(jìn)行發(fā)展態(tài)勢分析，對各指標(biāo)的綜合評判值進(jìn)行直觀地表達(dá)，避免了用多個指標(biāo)對其綜合評判值的人為判斷。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時檢測GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的含量，運(yùn)用化學(xué)計量學(xué)和GRA法對多組分定量檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析挖掘，并通過SPSS 26.0和SIMCA 14.1統(tǒng)計學(xué)軟件對其進(jìn)行綜合質(zhì)量評價，以期為GLX的整體質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

丹皮酚（批號：110708-201908，含量以99.8%計）、莪術(shù)醇（批號：100185-201908，含量以99.9%計）、α-香附酮（批號：110748-202117，含量以99.8%計）、莪術(shù)二酮（批號：111800-202203，含量以99.8%計）、芍藥苷（批號：110736-202246，含量以96.7%計）和紫丁香苷（批號：111574-202106，含量以94.3%計）由中國食品藥品檢定研究院提供；氧化芍藥苷（批號：14062505，含量以99.9%計）、雞矢藤次苷甲酯（批號：PRF8091244，含量以99.6%計）和車葉草苷酸（批號PRF8050928，含量以98.2%計）由成都普瑞法科技開發(fā)有限公司提供；黨參炔苷（批號：CFS202201，含量以98.5%計）、車葉草苷（批號：CFS202102，含量以98.2%計）、香附烯酮（批號：CFS202101，含量以98.5%計）和圓柚酮（批號：CFS202201，含量以98.4%計）由武漢天植生物技術(shù)有限公司提供；15批GLX（規(guī)格：每粒0.5g，批號：221202，221104，221103，221102，221002，220907，220603，220602，220601，220502，211205，211204，211203，211201，211104，編號分別為S1～S15）來源于山東步長神州制藥有限公司；乙腈（色譜級，天津市康科德科技有限公司）、磷酸（色譜級，美國Tedia公司），其余試劑為分析純。

KQ-300DV型超聲波清洗器（廣州穎漢科技有限公司）；Agilent 1200型HPLC儀（美國安捷倫科技公司）；AB104.N型電子天平（上海托利-梅特勒儀器有限公司）；色譜柱（規(guī)格250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikmatech Diamonsil Plus C18柱）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品 精密稱取黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇對照品各適量，用50%甲醇制成含黨參炔苷（0.192 mg/mL）、紫丁香苷（0.036 mg/mL）、雞矢藤次苷甲酯（0.590 mg/mL）、車葉草苷酸（0.414 mg/mL）、車葉草苷（0.530 mg/mL）、氧化芍藥苷（0.318 mg/mL）、芍藥苷（0.452 mg/mL）、丹皮酚（0.940 mg/mL）、香附烯酮（0.374 mg/mL、）圓柚酮（0.042 mg/mL）、α-香附酮（0.176 mg/mL）、莪術(shù)二酮（0.252 mg/mL）和莪術(shù)醇（0.118 mg/mL）的混合母液。精密量取混合母液，用50%甲醇稀釋20倍，即得。

2.1.2 供試品 取10粒GLX內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，經(jīng)50%甲醇超聲提取30 min，放冷，定容至25 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，備HPLC檢測用。取按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別制備的缺黨參、缺白花蛇舌草、缺牡丹皮、缺香附和缺莪術(shù)的陰性對照品，再依上法制成5個陰性對照品溶液，備HPLC檢測用。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn) 采用Dikmatech Diamonsil Plus C18色譜柱，流動相乙腈（A）-0.1%磷酸[7-10]梯度洗脫（0～9 min，17.0%A；9 ～17 min，17.0%→30.0%A；17 ～31 min，30.0%→33.0%A；31 ～45 min，33.0%→55.0%A；45 ～59 min，55.0%→65.0%A；59 ～71 min，65.0%→75.0%A；71 ～75 min，75.0%→17.0%A）；檢測波長為254 nm[11-13]（0～27 min，黨參炔苷和紫丁香苷）、235 nm[14-20]（27～38 min，雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮）和214 nm[21-22]（38～65 min，莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇）；柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL?；旌蠈φ掌?、供試品溶液色譜圖見圖1。結(jié)果GLX供試品中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇色譜峰的保留時間與對照品一致，且峰形尖銳，無雜質(zhì)峰干擾。

圖1 混合對照品（A）、GLX（B）、黨參陰性對照品（C）、白花蛇舌草陰性對照品（D）、牡丹皮陰性對照品（E）、香附陰性對照品（F）和莪術(shù)陰性對照品（G）色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察用50%甲醇將上述對照品母液稀釋4、10、20、40、100和200倍，搖勻，依法檢測黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇色譜峰，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸處理，結(jié)果見表1。

表1 GLX 中13 種成分回歸處理結(jié)果

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn) 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣同一份GLX（S1）供試品溶液6次，計算各成分峰面積的RSD值，結(jié)果黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇峰面積RSD值依次為1.46%、1.83%、0.96%、1.15%、1.05%、1.35%、1.13%、0.73%、1.23%、1.79%、1.52%、1.41%和1.56%。取同一份GLX（S1）供試品溶液（室溫存放），于制備后0、2、4、7、12、18、24和36 h進(jìn)樣，測得黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇峰面積RSD值依次為1.69%、1.93%、1.37%、1.47%、1.54%、1.74%、1.54%、1.14%、1.35%、1.98%、1.73%、1.80%和1.88%，表明GLX供試品溶液36 h內(nèi)穩(wěn)定。取6份編號S1的GLX，各自按“2.1.2”項(xiàng)方法處理成供試品溶液，依法檢測，記錄峰面積，代入回歸方程，用外標(biāo)法計算黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇含量，結(jié)果方法重復(fù)性良好，含量的RSD值依次為1.72%、1.98%、1.23%、1.48%、1.37%、1.59%、1.42%、1.02%、1.56%、1.92%、1.79%、1.67%和1.82%。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn) 取已知13種成分含量編號S1的GLX內(nèi)容物細(xì)粉9份，每份約0.5 g，精密稱定，隨機(jī)均分為3組，每組分別加入0.8、1.0、1.2 mL混合對照品溶液[黨參炔苷（0.107 mg/mL）、紫丁香苷（0.019 mg/mL）、雞矢藤次苷甲酯（0.398 mg/mL）、車葉草苷酸（0.311 mg/mL）、車葉草苷（0.372 mg/mL）、氧化芍藥苷（0.229 mg/mL）、芍藥苷（0.326 mg/mL）、丹皮酚（0.591 mg/mL）、香附烯酮（0.269 mg/mL）、圓柚酮（0.024 mg/mL）、α-香附酮（0.093mg/mL）、莪術(shù)二酮（0.152 mg/mL）和莪術(shù)醇（0.069 mg/mL）]，按“2.1.2”項(xiàng)方法制得加樣供試品溶液，低、中、高3個水平各平行3份，進(jìn)樣檢測，得黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇平均加樣回收率分別為98.31%、96.81%、99.45%、97.89%、99.58%、98.65%、98.17%、100.10%、99.43%、96.91%、97.79%、97.95%和98.48%，RSD值分別為1.49%、1.44%、1.37%、1.46%、0.93%、1.24%、1.29%、0.86%、0.78%、1.48%、1.03%、1.20%和1.15%。

2.4 GLX樣品含量檢測 取15批GLX（S1～S15）依法制成的GLX供試品溶液，進(jìn)樣，每批樣品檢測3次，記錄黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的峰面積，將13種成分峰面積代入“2.3.1”項(xiàng)回歸方程，計算其在樣品中的含量，結(jié)果見表2。

表2 15 批GLX 中13 種成分含量測定結(jié)果 （n=3）

2.5 GLX化學(xué)計量學(xué)質(zhì)量評價

2.5.1 主成分分析（PCA） 將15批GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0軟件進(jìn)行PCA，由PCA結(jié)果（表3~4）可知，前2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為90.626%，其中主成分1的占比為74.364%。由載荷矩陣可知，主成分1的信息由紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、α-香附酮和莪術(shù)醇組成，黨參炔苷、圓柚酮和莪術(shù)二酮對主成分2貢獻(xiàn)度顯著。為驗(yàn)證PCA的可信度，同時運(yùn)用SIMCA 14.1軟件對表2數(shù)據(jù)建立PCA模型，同樣提取出2個主成分，其中R2X＝0.906，表明模型穩(wěn)定可靠，進(jìn)一步分析得15批GLX樣品PCA得分圖（見圖2）。由圖2可知S1～S6位于得分圖左上側(cè)，S7～S10位于得分圖左下側(cè)，S11～S15位于得分圖右下側(cè)，批次相近的聚在一起。

圖2 15 批GLX 的PCA 得分圖

表3 特征值、方差貢獻(xiàn)及累積貢獻(xiàn)率

表4 GLX 中13 種成分的載荷矩陣

2.5.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 為進(jìn)一步比較GLX樣品組間質(zhì)量，發(fā)挖類間關(guān)異標(biāo)記物，將表2數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA，得OPLS-DA模型得分圖（見圖3），結(jié)果模型參數(shù)R2X＝0.906，R2Y＝0.878，Q2＝0.776，均大于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力良好。對OPLS-DA模型進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，得置換檢驗(yàn)圖（見圖4），結(jié)果截距R2＝0.072 2，Q2＝-0.454，同時各成分散點(diǎn)的R2和Q2值均低于最右側(cè)的R2和Q2值，由此表明OPLS-DA模型未過度擬合。根據(jù)模型變量重要性投影（VIP）圖（見圖5），以VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，VIP值越大，對產(chǎn)品質(zhì)量差異貢獻(xiàn)度越大，結(jié)果有8個成分的VIP值>1，VIP值從大到小依次為VIP莪術(shù)二酮=1.370 2、VIP香附烯酮=1.313 7、VIP丹皮酚=1.282 8、VIP車葉草苷=1.139 1、VIP黨參炔苷=1.119 1、VIP雞矢藤次苷甲酯=1.110 5、VIP芍藥苷=1.014 9、VIP氧化芍藥苷=1.014 4，其次成分4（車葉草苷酸）的VIP=0.995 7，接近1，對GLX質(zhì)量也有一定的影響。故這9個成分可作為影響GLX產(chǎn)品質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

圖3 15 批GLX 樣品OPLS-DA 模型得分圖

圖4 OPLS-DA 置換檢測結(jié)果圖

圖5 13 個測定指標(biāo)的VIP 圖

2.6 GRA

2.6.1 原始數(shù)據(jù)矩陣規(guī)格化 參考文獻(xiàn)[23]采用均值變換法對表2中15批GLX中黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的含量數(shù)據(jù)規(guī)格化處理，處理后數(shù)據(jù)見表5。

表5 GLX 中13 種成分含量數(shù)據(jù)規(guī)格化處理結(jié)果

2.6.2 計算關(guān)聯(lián)系數(shù) 以表5中每一成分的最大值為最優(yōu)參考序列，最小值為最差參考序列，結(jié)果最優(yōu)參考序列為1.307 4、1.593 8、1.291 8、1.301 7、1.340 2、1.531 7、1.344 8、1.256 2、1.487 1、1.368 7、1.380 7、1.338 9和1.341 3，最差參考序列為0.613 8、0.437 0、0.754 5、0.757 7、0.660 7、0.571 2、0.735 3、0.749 1、0.5081、0.662 3、0.697 2、0.599 4和0.690 6。按文獻(xiàn)[23]參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)計算公式分別計算各成分與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)（見表6）以及與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)（見表7）。

表6 各評價單元與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

表7 各評價單元與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.6.3 計算相對關(guān)聯(lián)度關(guān)聯(lián)度為每一批次GLX樣品中各個成分關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，按文獻(xiàn)[23]相對關(guān)聯(lián)度計算公式計算相對關(guān)聯(lián)度，結(jié)果與最優(yōu)參考序列關(guān)聯(lián)度、與最差參考序列關(guān)聯(lián)度和相對關(guān)聯(lián)度具體數(shù)據(jù)見表8。一般相對關(guān)聯(lián)度介于0～1之間，數(shù)值越大，樣品綜合質(zhì)量最優(yōu)。15批GLX樣品相對關(guān)聯(lián)度0.330 2～0.606 8，S11~S15分別位于排名前5位，S1~S6位于排名中間位置，S7~S10位于排名后4位。

表8 15 批GLX 相對關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果

3 討論

3.1 流動相選擇 本試驗(yàn)考察了以乙腈為有機(jī)相，水、0.1%甲酸液、0.05%磷酸液、0.1%磷酸液、0.2%磷酸液為水相的流動相系統(tǒng)對GLX中的黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的響應(yīng)值及分離效果。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸液為流動相時，基線平穩(wěn)，13種待測成分的檢驗(yàn)用時短、峰形及峰純度最優(yōu)，響應(yīng)值最大。

3.2 指標(biāo)組分選擇 GLX由牡蠣、香附（制）、三棱、莪術(shù)、土鱉蟲、仙鶴草、黨參、白術(shù)、白花蛇舌草、牡丹皮和吳茱萸11味中藥材配伍而成。方中牡蠣味咸、澀，性微寒，軟堅散結(jié)；香附味辛、微苦，性平，疏肝理氣，調(diào)經(jīng)止痛，兩藥合用，行氣消癥，散結(jié)止痛，共為君藥。三棱、莪術(shù)、土鱉蟲破血逐瘀，消積止痛；黨參、白術(shù)補(bǔ)氣健脾，以資化源。各藥相伍，祛瘀不傷正，扶正不留瘀，共為臣藥。白花蛇舌草清熱解毒，消腫止痛，伍仙鶴草、牡丹皮清熱涼血，活血散瘀；佐少量吳茱萸溫中散寒，防止苦寒傷脾陽，共為佐使。本方諸藥相合，通補(bǔ)兼施，溫清并用，共奏活血化瘀、軟堅散結(jié)之功。本試驗(yàn)遵循中藥質(zhì)量標(biāo)志物遴選原則，以君藥、臣藥和佐藥為研究對象，選取香附活性成分香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮，黨參代表性成分黨參炔苷和紫丁香苷，莪術(shù)主要成分莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇，白花蛇舌草藥效成分雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸和車葉草苷，以及牡丹皮特征成分氧化芍藥苷、芍藥苷和丹皮酚為指標(biāo)成分。

3.3 質(zhì)量評價結(jié)果分析 本試驗(yàn)采用HPLC法同步檢測了GLX樣品中13種化學(xué)組分含量，方法操作便捷，線性回歸、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率均符合《中華人民共和國藥典》要求，黨參炔苷、紫丁香苷、雞矢藤次苷甲酯、車葉草苷酸、車葉草苷、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚、香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、莪術(shù)二酮和莪術(shù)醇的含量分別為0.123～0.262 mg/g、0.017 ～0.062 mg/g、0.639 ～1.094 mg/g、0.482 ～0.828 mg/g、0.600 ～1.217 mg/g、0.242 ～0.649 mg/g、0.573 ～1.048 mg/g、0.929 ～1.558 mg/g、0.340 ～0.995 mg/g、0.030 ～0.062 mg/g、0.152～0.301 mg/g、0.171～0.382 mg/g、0.104～0.202 mg/g。從含量檢測結(jié)果來看，13種成分均存在一定差異，表明GLX多組分HPLC定量模式的應(yīng)用對提升和穩(wěn)定該制劑整體質(zhì)量具有參考意義。以15批GLX樣品中13種成分含量為質(zhì)量評價變量，分別建立了PCA和OPLS-DA模型，對復(fù)雜的多維數(shù)據(jù)進(jìn)行了降維，挖掘篩選出莪術(shù)二酮、香附烯酮、丹皮酚、車葉草苷、黨參炔苷、雞矢藤次苷甲酯、芍藥苷、氧化芍藥苷和車葉草苷酸對GLX質(zhì)量影響較大，是影響GLX產(chǎn)品質(zhì)量的主要標(biāo)記物。同時本研究采用GRA技術(shù)，建立了GLX樣品質(zhì)量優(yōu)劣評價模型，對評價對象進(jìn)行質(zhì)量排序，S11~S15分別位于排名前5位，相對關(guān)聯(lián)度由大到小依次為0.606 8、0.591 2、0.572 9、0.572 5和0.533 2，S7~S10位于排名后4位，相對關(guān)聯(lián)度由大到小依次為0.406 5、0.388 8、0.364 6和0.330 2，表明GRA模型可用于GLX樣品質(zhì)量優(yōu)劣評價。

本試驗(yàn)所建立的HPLC多組分定量聯(lián)合PCA、OPLS-DA等化學(xué)計量學(xué)以及GRA模型，操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、全面客觀，所檢測的13種分涵蓋了處方中君、臣、佐藥的大部分主要活性成分，可用于GLX綜合質(zhì)量評價，為該制劑質(zhì)量控制提供參考。由于試驗(yàn)所用樣品源于市場，樣品數(shù)量不夠大，其化學(xué)成分的差異性和關(guān)聯(lián)性還需要更多批次的樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)去研究。