當歸黃芪超濾物通過調控ROS/GSH/GPx4軸抑制鐵死亡改善放射性大鼠心肌纖維化

任春貞,陳其林,張啟立,呂欣芳,支曉東,高 翔,吳 雪,李曉靜,劉 凱,趙信科,李應東

(1. 甘肅中醫藥大學中西醫結合學院,2. 甘肅省中醫藥防治慢性病重點實驗室,3. 甘肅中醫藥大學附屬醫院,4. 甘肅中醫藥大學藥學院,甘肅 蘭州 730000)

放射性心肌纖維化(radiation-induced myocardial fibrosis,RIMF)是放射性心臟疾病終末病理改變,是成年人心力衰竭和心房顫動的主要原因[1-2],因此,對該病的防治應引起人們的高度重視[3]。近年來,驅動心肌細胞死亡的氧化應激與纖維化之間的機制為研究熱點,而鐵死亡作為一種特殊的細胞死亡方式,在各種心血管疾病疾病中,已相繼證實鐵死亡參與其病程的發生發展[4-7],然而在RIMF中未見相關的研究報道。因此,調控鐵死亡緩解RIMF為臨床治療提供潛在靶點。目前,RIMF的發生發展機制尚未得到明確闡述,而且缺乏有效的治療手段。研究發現,中藥防治RIMF已取得一定成效。因此,探索針對防治RIMF的新藥物具有重要意義。中醫學認為:輻射屬于火熱毒邪,會損傷人體的心氣心血,導致機體出現氣虛血瘀的癥狀。當歸和黃芪是我國傳統的益氣活血類中藥,在前期研究中,本課題組根據古方當歸補血湯中兩味中藥的配伍比例,采用超濾膜提取技術制備出了當歸黃芪超濾物(RadixAngelicaSinensisand RadixAstragalusultrafiltration extract,RAS-RA)。為了探討RAS-RA對RIMF的保護作用及機制,我們利用X射線建立了RIMF大鼠模型,并在此基礎上進行了實驗研究。這些研究結果為甘肅道地藥材的開發提供了理論依據,為進一步探討中藥治療RIMF的機制奠定了基礎。

1 材料與儀器

1.1 動物SPF級5周齡雄性Wistar大鼠50只,體質量為(200±20)g,購自于斯貝福(北京)生物技術有限責任公司,動物生產許可證號:SCXK9(京)2019-0010,在甘肅中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室內飼養,實驗動物使用許可證號:SYXK(甘)2021-0004。動物于相對濕度45%～55%、溫度(22±1) ℃、12 h光暗循環的環境下,適應性飼養2周,自由進食飲水。動物實驗經甘肅中醫藥大學科研實驗中心倫理委員會批準(批準號:2022-520)。

1.2 藥物RAS-RA為本課題組前期分離[8]所得,批號(國食健字:G20140331)。其中1 g RAS-RA相當于生藥11.11 g,每克原復方制劑中提取出0.09 g。

1.3 試劑GPx4抗體(批號 GB124327-100,武漢Servicebio公司);NOX1抗體(批號 DF8684,AffinitY公司);FTH1抗體(批號DF6287,AffinitY公司);α-SMA(批號: 100034,美國Gene Tex公司);Collagen I (批號270993,美國Abcam公司);GAPDH抗體(批號100118,美國Gene Tex公司);SOD、MDA、GSH試劑盒(批號A003-1、A003-1、A006-2-1,南京建成生物工程研究所);組織鐵測試盒(批號20230218,南京建成生物工程研究所);HE、Masson染色試劑盒(批號G1003、G1003,武漢賽維爾生物科技有公司);OCT包埋劑、PBS緩沖液、DAPI染色試劑(批號G6059-110ML、G0002、G1012,武漢Servicebio公司);ROS染液(批號D7008,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)。

1.4 儀器VINNO 6 LAB便攜式數字化彩色超聲診斷儀(蘇州飛依諾科技有限公司);透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司),X射線輻照儀(美國Faxitron公司)。Eppendorf移液槍、酶標檢測儀(美國USCN公司);包埋機(浙江省金華市俊杰電子有限公司);組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)。

2 方法

2.1 RAS-RA制備及質量控制RAS-RA根據金元名醫李東垣創立的當歸補血湯,課題組按原方比例將當歸、黃芪以1 ∶5用量,水煎煮3次,過濾雜質,煎煮濃縮,送甘肅省膜科所采用陶瓷膜微濾,選用中空纖維超濾膜,其截留分子量為100 ku(技術參數為壓力 0.5 kPa/m3,壓力5～6 kg·m-3,流量100 L/h·m2,溫度25 ℃),將超濾液噴霧后干燥成粉狀,存儲于4 ℃冰箱備用。RAS-RA的活性成分由高壓液相色譜分離分析。

2.2 RIMF大鼠模型的建立依據本實驗課題組前期研究、預實驗和相關文獻,建立X射線誘導大鼠心肌纖維化的模型[9]。大鼠照射前1 d禁食水,輻照時,首先用10%的水合氯醛將其麻醉,每只大鼠用量0.3 mL/100 g麻醉,麻醉后大鼠取仰臥位,輻射區域嚴格限定在大鼠心臟的區域,用鉛板擋住大鼠其余的表皮皮膚,48 cm的源表面距離(SSD)照射場進行X射線40 Gy單次局部輻照,輻照后常規飼養30 d后,主要根據心肌組織HE及Masson染色判斷RIMF造模是否成功。

2.3 分組及給藥SPF級6周齡Wiatar大鼠50只適應性飼養2周后,隨機分為5組,每組10只:① 空白組(Control);② 模型組(Model);③ 當歸黃芪超濾物低劑量組(RAS-RA-L);④ 當歸黃芪超濾物中劑量組(RAS-RA-M);⑤ 當歸黃芪超濾物高劑量組(RAS-RA-H)。除正常對照組不予輻射外,其余各組大鼠均經麻醉后接受40 Gy X射線單次局部胸部照射1次,建立放射性大鼠心肌纖維化。輻射后,當歸黃芪超濾物各干預組(低、中、高劑量)大鼠以0.12、0.24、0.48 g·kg-1劑量配以無菌蒸餾水灌胃(劑量按照人與大鼠體表面積法),空白組與模型組均接受等體積生理鹽水灌胃處理。每日一次,連續灌胃30 d。在實驗過程中,當歸黃芪超濾物中劑量及高劑量組大鼠各死亡1只,模型組及當歸黃芪超濾物低劑量組大鼠各死亡2只,死亡原因主要由于操作誤傷引起。

2.4 小動物心臟彩超將大鼠水合氯醛麻醉后,采用超聲探頭進行觀察,并測量左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)的變化。

2.5 比色法檢測心肌組織中MDA、GSH、Fe2+含量,SOD活性取大鼠左心室心肌組織,生理鹽水沖洗數遍后,制備心肌組織勻漿,嚴格按試劑盒說明書操作,用比色法檢測心肌組織中MDA、GSH、SOD、Fe2+活性。

2.6 大鼠心肌組織形態學觀察左心室組織用4%多聚甲醛固定,包埋切片,經脫蠟、水化,進行HE染色、Masson染色,封片后并在顯微鏡下觀察。

2.7 各組大鼠心肌組織超微結構觀察取大鼠左心室心尖部組織后浸入電鏡液中保存,進行固定、脫水、浸透等步驟,最后用透射電鏡觀察。

2.8 免疫熒光檢測心肌組織中ROS表達取大鼠左心室心尖部肌組織,常規切片、脫蠟、水化、染色、DAPI復染細胞核、封片等步驟,最后置熒光顯微鏡觀察。

2.9 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測鐵死亡及纖維化的蛋白表達心臟(左心室心尖部)總蛋白樣品采用RIPA緩沖液提取,15 μg蛋白通過12% SDS-PAGE電泳分離,轉移到聚偏氟乙烯(VDF)膜上。在封閉緩沖液(5%牛奶加TBST)中輕輕搖晃2 h。隨后,將膜與一抗孵育過夜。然后,將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗結合2 h。采用ECL Western blot試劑盒和增強化學發光系統檢測蛋白條帶。所有測得的蛋白水平均采用ImageJ軟件進行灰度值分析。

3 結果

3.1 RAS-RA成分及質量控制高壓液相色譜分離分析RAS-RA主要活性成分為當歸阿魏酸、黃芪甲苷、黃芪多糖、當歸多糖、芒柄花素。本研究所采用的RAS-RA指紋圖譜,見Fig1。

Fig1 RAS-RA fingerprint map

3.2 RAS-RA對各組大鼠的一般情況的影響空白組大鼠精神煥發,活動自如,食欲佳,飲水穩定,體重持續增長;然而,模型組大鼠則精神不振,毛發枯黃并出現脫毛現象,活動能力明顯降低,食欲不振,體型明顯消瘦;RAS-RA各干預組大鼠的上述癥狀均得到了一定程度的改善。

3.3 RAS-RA對各組大鼠心功能指標的影響與正常組比較,模型組大鼠LVEF、LVFS表達降低(P<0.05)。與模型組比較,RAS-RA各干預組大鼠LVEF、LVFS表達升高(P<0.05),見Tab1。

Tab1 Detection results of cardiac function indicators in each group of

3.4 RAS-RA對各組大鼠心肌組織中SOD、GSH、MDA、Fe2+活性的影響與正常組比較,模型組大鼠心肌組織MDA、Fe2+水平升高,SOD、GSH水平下降(P<0.01);與模型組比較,RAS-RA干預組大鼠心肌組織MDA、Fe2+水平下降,SOD、GSH水平升高(P<0.01),見Fig2。

Fig2 Oxidative stress indicators and Fe2+ levels in heart tissue of each **P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs Model group.

3.5 RAS-RA對大鼠心臟組織ROS熒光強度表達變化的影響空白組大鼠心肌組織中熒光信號不明顯,ROS表達正常;輻射組大鼠心肌組織中熒光信號強,ROS紅色熒光表達增強(P<0.05);RAS-RA低、中、高劑量組大鼠心肌組織中ROS紅色熒光表達減弱(P<0.05),見Fig3和Tab2。

Tab2 Results of ROS fluorescence intensity expression in myocardial tissue of rats in each

Fig3 Changes in ROS expression in myocardial tissue of rats in each group (×200)

3.6 RAS-RA對各組大鼠心肌組織病理形態學及心肌纖維化的影響正常組大鼠的心肌細胞排列整齊,肌纖維連接緊密,胞核清晰;輻射模型組大鼠心肌組織可見小面積肌細胞壞死溶解,核固縮,結締組織增生,肌纖維斷裂,排列較紊亂,有炎性胞侵潤;RAS-RA干預組大鼠心肌細胞排列較整齊,肌纖維斷裂較少,部分間隙稍有增寬,少量炎性細胞侵潤,見Fig4。

Fig4 Observation of myocardial tissue structure in each group of rats (HE staining,× 200)

與正常組比較,模型組大鼠心肌組織中膠原纖維陽性面積增多,心肌纖維化程度加重(P<0.05,如藍色部分所示);與模型組比較,RAS-RA干預組大鼠心肌中膠原纖維陽性面積減少,心肌纖維化程度減輕(P<0.05),見Fig5和Tab3。

Tab3 Results of positive area of myocardial

Fig5 Fibrosis of myocardial tissue in each group (Masson staining,×200)

3.7 RAS-RA對各組大鼠心肌組織超微結構的影響正常組心肌損傷程度相對偏低,肌絲完整,排列整齊緊密,線粒體排列整齊,形態正常,邊界清晰,嵴明顯;模型組肌絲排列疏松紊亂,斷裂,受損線粒體增多、變小、排列紊亂,形態不規則,嵴紊亂,部分線粒體出現腫脹及空泡;RAS-RA干預組心肌肌絲排列較整齊,線粒體排列較整齊,形態較規則,個別線粒體輕微腫脹,嵴大多排列整齊,少量斷裂,見Fig6。

Fig6 Changes in myocardial ultrastructure of rats in each group (transmission electron microscopy,× 8 000)

3.8 RAS-RA對各組大鼠心肌組織鐵死亡及纖維化的蛋白表達的影響與空白組比較,模型組大鼠α-SMA、Collagen Ⅰ、NOX1蛋白表達升高,GPx4,FTH1蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組比較,RAS-RA中、高劑量組大鼠GPx4,FTH1蛋白表達升高,α-SMA、Collagen I、NOX1蛋白表達降低(P<0.05),見Fig7和Tab4。

Tab4 Relative expression levels of myocardial tissue proteins in each group of rats

Fig7 Relative protein expression of each group of rats A:Control;B:Model;C:RAS-RA-L;D:RAS-RA-M;E:RAS-RA-H

4 討論

中醫學認為X射線屬于“火熱毒邪”,而RIMF屬于火熱毒邪損傷心氣、心血的致病范疇,其基本病機以氣血虧虛,血脈瘀阻為主,故治療上以“補氣生血、扶正祛瘀”為主,藥選補益氣血的當歸和黃芪,二者聯合應用可以對于治療RIMF發揮出協同作用,增強治療效果。據相關研究表明[10-11]:當歸多糖具有促進心肌細胞增殖、抑制細胞凋亡及抗放射性心肌損傷的作用。丁艷平等[12]研究發現,黃芪甲苷具有顯著抗輻射性肺損傷的作用。劉蘭婷等[13]研究報道,黃芪甲苷可能通過激活用短鏈?；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD),從而抑AngII誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原表達。當前認為當歸黃芪及其活性成分具有抗輻射損傷作用,但關于RAS-RA通過調控鐵死亡機制來防治RIMF的研究尚未見相關的文獻報道。因此,本研究旨在全面剖析RAS-RA對防治RIMF的效果,并對其相關的作用機理進行深入闡述。

近年來研究發現,鐵死亡在心血管疾病中扮演著重要角色。鐵死亡是由細胞內鐵離子累積并催化產生ROS驅動的,產生大量脂質過氧化物,由谷胱甘肽(glutathione,GSH)過氧化物酶4(GPx4)控制的細胞內微環境氧化還原狀態紊亂引起的一種調節細胞死亡。氧化應激是引起鐵死亡的主要原因。脂類過氧化反應是細胞內重要的生物化學過程,其產物MDA不僅可以直觀地反映機體內的脂類過氧化程度,還可間接地反映出自由基對心臟的損傷程度。SOD可幫助清除機體內過量的氧自由基,降低ROS積累對生物膜所造成的損害,對機體的氧化和抗氧化系統平衡、阻斷脂質過氧化程度起著至關重要的作用。GSH在人體內發揮著重要的生理功能,其中包括清除自由基和促進鐵質吸收,也是細胞內一種重要的抗氧化劑,是衡量機體抗氧化能力的重要物質,在鐵死亡中均發揮著重要的作用。此外,GPx4是一種脂質修復酶,硒蛋白家庭的唯一成員,其可通過阻斷ROS介導的脂質過氧化來抑制鐵死亡,通常被用作鐵超載的重要分子標記[14]。FTH1是一種新型的保護性分子,是一種獨立的因子,與GPx4和GSH協同抑制磷脂過氧化反應和鐵中毒[15]。NOX是細胞內非線粒體源ROS生成的主要酶體,也稱為NADPH氧化酶。它是胞內過氧化物酶系統中的一種酶,介導ROS的產生。NOX1是促進活性氧生成的主要來源[16],ROS是機體氧化應激損傷過程中最主要的產物之一。而ROS的累積是鐵死亡的標志之一,研究表明,鐵死亡抑制劑可以減少細胞中ROS的累積并抑制鐵死亡[17]。然而心肌纖維化發生發展與膠原纖維蛋白過度分泌和異常沉積是密不可分的。研究證實,心肌成纖維細胞快速增殖可導致細胞外基質膠原蛋白α-SMA、Collagen I的沉積,膠原蛋白分泌異常[18],最終導致心臟纖維化。本研究發現:與空白組相比較,模型組大鼠心臟組織透射電鏡示線粒體數量稀疏、排列紊亂,受損線粒體較多,可見膜破裂、嵴斷裂模糊不清,有明顯的鐵死亡形態學改變;細胞間質出現明顯纖維組織增生伴炎癥細胞浸潤,心肌纖維化明顯;免疫熒光檢測ROS水平上升,比色法檢測心肌組織中Fe2+、MDA水平上升、GSH、SOD水平下降;心肌組織中α-SMA、Collagen I、NOX1蛋白表達升高,而GPx4、FTH1蛋白表達下降,可見放RIMF大鼠存在鐵死亡及氧化應激損傷。與模型組比較,RAS-RA各治療組大鼠心功能改善,脂質過氧化、抗氧化相關指標恢復;Fe2+含量降低;線粒體結構恢復;纖維化程度減輕;心肌組織中α-SMA、Collagen I、NOX1蛋白表達下降,GPx4,FTH1蛋白表達上升。

綜上所述,RIMF大鼠存在亞鐵離子積累、脂質過氧化、ROS積累等鐵死亡特征性改變和氧化應激損傷,RAS-RA具有顯著的抗氧化作用,可能是通過抑制Fe2+,抑制鐵死亡,降低脂質過氧化產物MDA水平,減少ROS的積累,減輕氧化應激損傷,從而改善心功能,通過調控ROS/GSH/GPx4軸抑制心肌鐵死亡減緩RIMF的發生發展。為了進一步驗證結果,后續的研究計劃通過細胞實驗,使用鐵死亡抑制劑、激動劑干預,觀察相關指標情況,進一步深入探索并闡明RIMF的發病機制,為臨床防治RIMF提供實驗依據。