宮頸脫落細胞HPVE6/E7 mRNA檢測在宮頸癌早期篩查與HPV分型診斷中的應用

任玉峰 王兆輝 段秀芳 徐娜 張妍

宮頸癌是婦科常見三大惡性腫瘤之一，近年來，年輕女性宮頸癌的發病率呈逐漸上升的趨勢。臨床研究結果顯示，醫學干預可有效預防宮頸癌的發生，及早篩查和診斷癌前病變且配合治療，治愈率在90%以上［1］。宮頸癌癌前病變早期缺乏特異性臨床表現，不易察覺，早期篩查對患者的診斷顯得尤為重要。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染與宮頸癌的發生發展密切相關，尤其是高危型人乳頭瘤病毒感染（highrisk human papilloma virus， HR-HPV）患者，癌變風險顯著增加［2］。HPV內部的E6/E7癌基因表達產生E6/E7癌蛋白，E6蛋白通過抑制P53而阻斷凋亡，E7蛋白抑制pRB使細胞周期失控，致使宮頸癌的發生。而HPV E6/E7 mRNA是E6/E7癌基因表達的直接產物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宮頸病變開始和進展為宮頸癌的必要條件。因此，HPV E6/E7 mRNA檢測是宮頸癌風險程度的重要評估方法［3］。HPV E6/E7 mRNA 陽性率及拷貝數與宮頸癌中HPV的分型有無相關性，尚不明晰。本研究收集安康市婦幼保健院268例宮頸癌疑似患者的臨床病歷資料，探討宮頸脫落細胞E6/E7 mRNA對宮頸癌與HPV分型的診斷價值，旨在為臨床進一步病理活檢和早期臨床干預提供依據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2020年3月安康市婦幼保健院收治的268例疑似患者作為研究對象。年齡22～65歲，平均（40.72±9.147）歲；身體質量指數（body mass index，BMI）為（20.35±1.92）kg/m2。宮頸癌診斷標準以組織學診斷結果為金標準。根據病理診斷意見分為宮頸癌組（n=140）和非宮頸癌組（n=128）；268例患者根據HPV分型結果分為高危型組（n=212）和非高危型組（n=56，包括低危型組15例，低危混合組41例）。納入標準：①患者可見接觸性出血，絕經患者可見陰道不規則出血或白帶帶血；②B超或CT檢測發現宮頸贅生物；③白帶增多；④患者及家屬知情同意，并自愿簽署知情同意書。排除標準：①患者術前進行過放化療史；②合并急性婦科炎癥者；③合并其它惡性腫瘤者。本研究通過倫理委員會審批（審批文件號：2018031）。

1.2 檢查方法 宮頸脫落細胞收集：收集前3 d禁止性生活，并用生理鹽水沖洗陰道。采用內窺器擴張陰道，暴露宮頸。將宮頸細胞專用刷插入宮頸口，順時針旋轉5周，采集脫落宮頸細胞。留置在專用杯中，編號，冷凍保存備用。

HPV E6/E7 mRNA檢測：采用支鏈DNA技術（b-DNA）檢測HPV E6/E7mRNA。取備用宮頸脫落細胞標本，離心取上清液送檢。以200 μL裂解液+400 μL雙蒸水+5 μL蛋白酶K對標本進行裂解。將裂解后的標本液50 μL加入樣本檢測孔，并加入50 μL標本緩沖液，加載好后封閉，55℃孵育3.5 h。完成后以洗脫液洗板，依次加入預放大和放大分子、探針標記物各100 μL，每孔，期間均行55℃雜交處理。完成后46℃孵育0.5 h。采用冷光檢測儀讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數，以E6/E7＞1.0為結果陽性［4］。

HPV分型檢查：采用YN-H18型全自動核酸分子雜交儀檢測HPV E6/E7 mRNA，相應試劑盒購自亞能生物技術有限公司，操作嚴格按說明書進行。參照標準記錄HPV分型［5］，以HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82型為高危型HPV，以HPV 6、11、42、43、44、81型為低危型HPV。高危型病毒單獨感染及存在高危型病毒的混合感染定義為高危組；低危型病毒單獨感染定義為低危組；低危混合型為低危型病毒混合感染；低危型和低危混合型總歸于非高危組。

1.3 確診方法 宮頸癌需要兩名主治醫師及以上職稱進行病理診斷采用雙盲法進行確診，對于安康市婦幼保健院及寧夏第五人民醫院兩家醫院意見不一致者，由第三家醫院棗莊市立醫院做診斷，最后對結果進行討論，最終結果作為宮頸癌確診病例。

1.4 觀察指標 記錄268例研究對象一般資料（年齡、BMI、文化程度、孕次、產次、吸煙史、初次性生活時間、性伴侶個數、陰道分泌物情況、甲狀腺疾病、CA125、SCC、HPV分型）及HPVE6/E7 mRNA 拷貝數并進行分組比較。

1.5 統計學方法 選用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以表示，組間行獨立樣本t檢驗，不符合正態分布時以M（P25，P75）表示，組間行秩和檢驗；計數資料以例和率表示，組間行χ2檢驗，多因素分析采用logistic回歸分析，判斷準確性采用受試者工作曲線（receiver operator characteristics， ROC）分析，結果以曲線下面積（area under the curve， AUC）表示，組間比較行Z檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者基本情況比較 宮頸癌組與非宮頸癌組年齡及BMI的比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 宮頸癌和非宮頸癌組年齡及BMI比較（）

表1 宮頸癌和非宮頸癌組年齡及BMI比較（）

組別宮頸癌組非宮頸癌組t值P值例數140 128年齡（歲）40.03±8.665 41.47±9.625 0.319 0.750 BMI（kg/m2）20.43±2.051 20.12±1.892 0.259 0.796

2.2 不同患者HPV E6/E7 mRNA比較 宮頸癌與非宮頸癌組不同HPV分型組HPVE6/E7 mRNA陽性率和拷貝數差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 宮頸癌組和非宮頸癌組HPV E6/E7 mRNA比較

表3 高危型HPV組、低危型HPV組及低危混合型HPV組HPVE6/E7 mRNA 的比較

2.3 logistic多因素回歸分析 納入單因素分析中差異有統計學意義的變量進入多元模型（變量賦值見表4），采用逐步向前選擇變量，以宮頸癌為因變量（否0，是1），結果顯示：文化程度初中及以下、孕次≥3次、初次性生活時間＜18歲、鱗狀細胞癌抗原（SCC）＞2 ng/mL及HPVE6/E7 mRNA陽性是宮頸癌的高危因素（P＜0.05）。見表5。以高危型HPV為因變量（否0，是1），結果顯示：年齡（35～65歲），孕次≥3次、性伴侶≥3個、陰道分泌物異常及HPVE6/E7 mRNA陽性是高危型HPV的獨立危險因素（P＜0.05）。見表6。

表4 變量賦值表

表5 宮頸癌logistic回歸分析

表6 高危型HPV logistic回歸分析

2.4 單項與聯合檢測宮頸癌的價值分析 以宮頸癌為狀態變量，孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA和多項聯合為檢測變量繪制ROC曲線，結果顯示：孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA 及多項聯合的AUC分別為0.625、0.671、0.691、0.632和0.826，最佳截值分別為1.14次、47.76歲、1.96 ng/mL、47 969拷貝數、1.210。孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA 和多項聯合具有良好的靈敏度和特異度，Z檢驗顯示聯合檢測概率的AUC顯著高于其他單項檢測指標（P＜0.05）。見表7，圖1。

圖1 單項及聯合檢測判斷宮頸癌的ROC曲線

表7 單項及聯合檢測宮頸癌的價值分析

2.5 單項與聯合檢測高危型HPV的價值分析 以高危型HPV為狀態變量，年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA和多項聯合為檢測變量繪制ROC曲線，結果顯示年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 及多項聯合的AUC分別為0.639、0.662、0.642、0.648、0.631和0.880，最佳截值分別為49.92歲、1.207次、3.025個、陰道分泌物異常、51735拷貝數、1.137。年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 和多項聯合具有良好的敏感度和特異性，Z檢驗顯示聯合檢測概率的AUC顯著高于其他單項檢測指標（P＜0.05）。見表8和圖2。

圖2 單項與聯合檢測判斷高危型HPV的ROC曲線

表8 單項及聯合檢測判斷高危型HPV的價值分析

3 討論

目前，宮頸癌是婦科僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤。HPV是具有雙鏈環狀結構的DNA病毒，當HPV感染宿主后以整合狀態存在宿主細胞DNA后，可引起基因表達缺失或突變，同時影響抑癌基因正常表達［6］，在宮頸癌的發生發展中發揮重要作用［7］，成為宮頸癌變的誘因。本研究顯示年齡35～65歲是高危型HPV高發群體，可能是因該階段患者性生活活躍，受孕、流產次數較多，造成的機械性損傷使高危型HPV感染機率增加［8］。臨床也有學者發現高齡婦女因雌激素水平降低，機體免疫功能減退，使HPV防御能力下降，而年輕女性因對性行為認知的不同，性伴侶多，性行為時不注意安全衛生，高危型HPV感染率也在上升［9］。綜上所述，筆者認為年齡在高危型HPV感染中的影響無直接相關性，是多種復雜因素協同的結果，年輕患者主要與性伴侶多有關，這與本文中的研究結果一致。另外，本研究發現孕次、陰道分泌物異常也是高危型HPV的獨立影響因素，這與既往報道一致［10］。因而，改變不良生活習慣，注意身體衛生有助于降低HPV風險。但上述因素涉及個人隱私，可控性與穩定性較差［11］，臨床有待更多的實驗室指標檢測及實驗病例的擴充，以精準檢測HPV分型和宮頸癌變風險。

宮頸脫落細胞學檢查作為宮頸癌的早期篩查方法已在臨床廣泛應用，成為共識［12］。而E6、E7是HPV早期編碼區的基因，報道證明E6可能利用泛素-蛋白酶體系降解PDZ蛋白，進而加快棘細胞層細胞惡性增殖，而E7可競爭性結合pRb CR2區特殊結構結合位點，抑制pRb抑瘤活性，誘導細胞惡變［13］。武振宇［14］研究顯示，FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變程度存在顯著相關性，宮頸病變程度越嚴重，FIS1mRNA表達量呈降低趨勢，而HPV E6/E7 mRNA表達量呈上升趨勢，與本文研究結果一致。相關研究顯示，HPV E6/E7 mRNA 聯合液基細胞學檢查在宮頸癌篩查中有重要作用［15-17］。此外，還有報道顯示E6、E7參與了高危型HPV 病毒免疫監視和免疫逃逸途徑，使機體長期處于高危型HPV感染狀態［18］，增加癌變機率。朱行行等［19］研究發現，高危型-HPV E6/E7 mRNA檢測在新疆維吾爾族婦女宮頸病變分層管理中有著重要應用價值，可當作二線篩查指標。王小紅等［20］研究發現，高危型HPV E6/E7 mRNA 表達水平有助于篩查宮頸癌變和HPV分型。這與本研究也發現HPV E6/E7 mRNA是宮頸癌與高危型HPV感染共同的高危因素，可能與此有關結果相一致。這也說明監測宮頸脫落細胞中HPV E6/E7 mRNA表達水平有助于篩查宮頸癌變和HPV分型。

本研究通過logistic多因素回歸分析探討宮頸癌與高危型HPV的獨立影響因素，比較HPV E6/E7 mRNA單項與多項聯合檢測對檢測宮頸癌與HPV分型的價值，結果發現HPV E6/E7 mRNA多項聯合檢測較單項檢測AUC顯著提高，提示HPV E6/E7 mRNA多項聯合檢測有助于提高判斷宮頸癌與HPV分型的準確性，其在篩查宮頸癌與檢測HPV分型方面具有可行性。

綜上所述，基于HPV E6/E7 mRNA檢測的多項聯合檢測概率可用于宮頸癌篩查和高危型HPV的診斷。