基于代謝組學(xué)探究疏調(diào)氣機湯治療甲狀腺功能減退癥的作用機制

郭爽,張利軍,龍小妹,古建興,劉海鵬,范源,3

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,云南 昆明 650041;3.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650021)

甲狀腺功能減退癥(hypothyroidism),簡稱甲減,是由于甲狀腺激素合成及分泌減少,或其生理效應(yīng)不足所致機體代謝降低的一種疾病。流行病學(xué)顯示,我國甲減患病率約為17.8%,且女性患病率大于男性,隨年齡增長,患病率增加[1]。臨床多以藥物優(yōu)甲樂為主,但需長期用藥。我國是世界上認識甲狀腺疾病最早的國家[2],中醫(yī)理論中并無甲狀腺疾病的概念,將頸前喉結(jié)兩旁結(jié)塊腫大為臨床特征的疾病歸類為“癭病”范疇[3]。情志內(nèi)傷、水土因素、體質(zhì)因素和外感六邪導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰凝結(jié)于頸部,是癭病的基本病機,臨床多以疏肝健脾、理氣和血為主。

疏調(diào)氣機湯是國醫(yī)大師張震的用藥經(jīng)方,他認為疏調(diào)人體氣機須以疏利理氣與調(diào)護脾腎相結(jié)合,提出“疏肝為體,健脾補腎為兩翼”之基本治療理念[4]。疏調(diào)氣機湯以柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳實、白芍、白術(shù)、茯苓、山藥、仙靈脾、薄荷和生甘草組成,具有疏調(diào)氣機之功效,臨床甲減可用以治療氣機失調(diào)諸證[5]。甲減在中醫(yī)辨證中主要表現(xiàn)為腎陽虧虛、脾腎陽虛、心腎陽虛、氣血兩虛、陰陽兩虛等癥狀[6];疏調(diào)氣機湯治療甲減,可養(yǎng)其脾腎,補其氣虛,起到對癥治療的效果。本研究通過代謝組學(xué)探究疏調(diào)氣機湯治療甲減作用機制,可為后續(xù)單體治療甲減及甲減的臨床治療提供實驗數(shù)據(jù)及新思路。

1 材料

1.1 儀器質(zhì)譜儀(Thermo Scientufic公司);Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜儀(Shimadzu公司);Bioruptor超聲波系統(tǒng)(Diagenode公司);Concentrator真空離心濃縮機(Eppendorf公司);5430R離心機(Eppendorf公司);MultiSkan FC可見紫外分光光度計(Thermo公司)。

1.2 試劑甲醇、乙腈、甲酸(Millipore公司);氨水(Merck公司);乙酸銨(Sigma公司);水合氯醛(天津市光復(fù)精細化工研究所);促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)、血清游離三碘甲狀腺原氨酸(Free Triiodothyronine,FT3)、血清游離甲狀腺素(Free Thyroxine,FT4)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 藥物中藥飲片柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳實、白芍、白術(shù)、茯苓、山藥、仙靈脾、薄荷、生甘草均購自昆明益生藥業(yè)有限責(zé)任公司,飲片均由云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室李宏哲副教授鑒定為臨床藥用飲片;優(yōu)甲樂(Merck KGaA公司,批號:JX20190041);丙硫氧嘧啶(上海朝暉藥業(yè)有限公司,批號:2108N13)。

1.4 動物30只SPF級雄性SD大鼠,體重均為(200±10)g,購于云南致力科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動物房,大鼠生長環(huán)境為室溫25 ℃,濕度60%,自由飲水。動物實驗研究方案已經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(批準號:R-062021G088)。

2 方法

2.1 動物模型建立及給藥SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為正常組5只和造模組25只。造模組大鼠進行丙硫氧嘧啶(1 mg/100 g)每天灌胃給藥造模兩周。兩周后眼底靜脈取血,離心得上清,檢測TSH、FT3、FT4指標變化水平,確定模型建立成功。將造模成功大鼠隨機分為模型對照組、陽性藥(優(yōu)甲樂)組(9 μg·kg-1)、疏調(diào)氣機湯低濃度組(10.3 g·kg-1)、疏調(diào)氣機湯中濃度組(20.6 g·kg-1)、疏調(diào)氣機湯高濃度組(41.2 g·kg-1),每組5只。給藥組分別進行灌胃,正常組和模型對照組同等劑量飲用水灌胃,持續(xù)給藥6周。大鼠末次給藥后,夜間禁食12 h,自由飲水,稱重,腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,靜置4 h,4 ℃,5 000 r·min-1離心取血清并分裝,-80 ℃保存。取甲狀腺組織置離心管內(nèi),液氮速凍后-80 ℃保存。

2.2 生化指標檢測大鼠腹主動脈取血,離心,取上清,試劑盒ELISA檢測FT3、FT4、TSH濃度,比較表達水平。

2.3 血清代謝組學(xué)對血清進行代謝物提取,取上清液進行LC-MS/MS檢測。色譜分析采用SHIMADZU-LC30超高效液相色譜系統(tǒng)使用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm,2.1 mm × 100 mm)進行分離。色譜分離條件:進樣量為3 μL,柱溫25 ℃,流速0.3 mL·min-1;流動相A:水+25 mmol·L-1乙酸銨,B:乙腈。質(zhì)譜分別采用電噴霧電離(ESI)進行正離子和負離子模式檢測,樣品經(jīng)UHPLC分離后,使用QE Plus質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析,使用HESI源進行離子化。使用MSDIAL軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對得到的數(shù)據(jù),刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰,對正負離子數(shù)據(jù)進行總峰面積歸一化,并整合,使用R軟件進行模式識別,數(shù)據(jù)經(jīng)Unit variance scaling(UV)預(yù)處理后,進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)方法處理,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,多組間數(shù)據(jù)差異顯著性方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠模型建立體重及進食量變化每天記錄大鼠體重,同時稱重兩次灌胃之間24 h飼料重量,計算差值,觀察大鼠進食情況。造模期間,正常組與模型對照組大鼠體重均增加,但模型對照組體重增長呈均勻線性增長,正常組每天無明顯增長趨勢。模型對照組大鼠進食量明顯小于正常組,且隨著造模時間增加,進食量差異越明顯(見表1)。

表1 大鼠體重、進食表

3.2 大鼠血清指數(shù)水平變化大鼠給藥6周后血清ELISA檢測指標表達水平,與正常組相比,疏調(diào)氣機湯對甲減大鼠TSH存在明顯的降低作用,可顯著增加FT3、FT4表達水平(見圖1)。

a.TSH;b.FT3;c.FT4;C.正常組;M模型對照組;Y.陽性藥組;D.疏調(diào)氣機湯低濃度組;Z.疏調(diào)氣機湯中濃度組;G.疏調(diào)氣機湯高濃度組

3.3 大鼠血清代謝組學(xué)分析

3.3.1 血清正、負離子色譜對比大鼠血清正、負離子色譜峰3個樣本重復(fù)結(jié)果,表明代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高,信號穩(wěn)定性較好(見圖2)。

A.正離子;B.負離子

3.3.2 主成分分析偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法。該方法運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品類別之間的關(guān)系模型,來實現(xiàn)對樣品類別的預(yù)測。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法,R2Y和Q2越接近于1,模型越穩(wěn)定可靠。從圖3中可見,R2Y均大于0.99,Q2均大于0.5,即表明模型穩(wěn)定,且模型的預(yù)測能力好(R2、Q2為回歸直線與Y軸的截距)。

A.PCA;B.OPLS-DA

3.3.3 差異代謝物篩選以 VIP>1,P<0.05,差異倍數(shù)(FC)>1.5 為上調(diào), FC<0.667為下調(diào)作為篩選標準選取顯著差異代謝物。正常組與模型對照組比較,共有312個顯著差異代謝物,其中111個代謝物水平上調(diào),198個代謝物水平下調(diào),根據(jù)VIP值排序,比較模型對照組與正常組血清潛在標記物,對前20個代謝物進行信息匯總(見表2)。疏調(diào)氣機湯高劑量組與模型對照組比較,共有91個顯著差異代謝物,其中有47個代謝物水平上調(diào),39個代謝物水平下調(diào),選擇前50個血清潛在標記物作熱圖以明顯表示其變化(見圖4),顏色越紅表示相對表達量越高,越藍表示相對表達量越低。

圖4 大鼠血清差異代謝物聚類熱圖

表2 前20血清標記物信息(C vs M)

3.3.4 代謝通路分析根據(jù)“3.3.3”項下分析所得,對血清潛在標記物進行分類(見圖5),對KEGG分析所得前30條作用通路作氣泡圖(見圖6),結(jié)果顯示血清潛在標記物主要為生物堿類(alkaloids)、縮氨酸類(peptides)、聚酮類(polyketides)、脂肪?；?FA)、異戊二烯脂類(prenol lipids)等;主要作用通路為中心碳循環(huán)、氨基酸生物合成、膽汁分泌等信號通路。

圖5 差異代謝物KEGG分類環(huán)形圖

圖6 KEGG富集通路氣泡圖

4 討論

相關(guān)研究表明,部分中藥方劑對甲減具有良好的治療作用:海藻玉壺湯可明顯改善甲狀腺腫大,保護肝腎功能[7-8];右歸丸可明顯改善甲減陽虛證大鼠癥狀,起到溫腎壯陽、滋補精血的作用[9];芪桂湯通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸,發(fā)揮其補腎助陽、益氣健脾功效,對甲減大鼠起到治療作用[10]。經(jīng)實驗結(jié)果顯示,疏調(diào)氣機湯能明顯降低大鼠血清TSH表達水平,升高FT3、FT4表達水平,改善甲減表征,存在較好的治療效果。相關(guān)文獻表明,FT3、FT4、TSH可視為甲減的最佳生物標記物[11],即表明本實驗所用血清標記物可作為治療效果評估的指標[12]。

疏調(diào)氣機湯具有疏肝理氣、健脾補腎,輔以活血清熱、化痰消積功效,方中柴胡疏肝解郁、調(diào)達氣血;香附、郁金疏肝行氣,增強柴胡之功;丹參活血祛瘀;川芎活血行氣;茯苓與白術(shù)健脾益氣、燥濕利水;薄荷疏肝行氣,枳實破氣寬中,增強疏調(diào)氣機之功;仙靈脾溫補腎陽,與茯苓、白術(shù)調(diào)護先后天之本;生甘草調(diào)和諸藥,緩和藥性;白芍養(yǎng)血斂陰、平肝柔肝,與甘草配伍,則“酸甘化陰”更能發(fā)揮其柔肝養(yǎng)血緩急之作用。諸藥共奏疏肝解郁、調(diào)補脾腎、理氣和血之功效,適用于肝氣郁結(jié)、氣機失暢、脾腎不足之疾病[13]。

在本研究中,疏調(diào)氣機湯對甲減大鼠血清內(nèi)代謝組分析,主要代謝物TOP 5分別是花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、麥角克堿、半乳糖醛酸、α-酮戊二酸?；ㄉ南┧崾侨梭w大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質(zhì),在體內(nèi)可誘導(dǎo)血小板聚集和刺激脂多糖[14],具有抗炎[15]、影響脂代謝等作用[16];DHA在大腦及神經(jīng)發(fā)育中起到作用,具有抗炎、促凋亡等藥理作用[17-18];麥角克堿臨床常用于治療閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、雄性激素低下等疾病治療[19];半乳糖醛酸具有抗氧化等活性[20];α-酮戊二酸為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,具有抗癌[21]、抗氧化[22]等藥理作用,以上變化說明疏調(diào)氣機湯在治療甲減的治療機制中,可影響三羧酸循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、脂代謝等,提示疏調(diào)氣機湯對甲減的治療作用多以調(diào)節(jié)抗炎、抗氧化代謝為主。

綜上,疏調(diào)氣機湯對甲減具有良好的治療作用,通過對大鼠血清潛在標記物分析,疏調(diào)氣機湯可調(diào)節(jié)部分血清標記物變化,可在一定程度上影響大鼠代謝,起到抗炎等藥物活性,進而發(fā)揮治療作用;利用血清標記物對機制進行預(yù)測,涉及多條作用機制,其具體機制還需深入探究。本實驗為甲減臨床治療及疏調(diào)氣機湯應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù),可為后續(xù)相關(guān)實驗提供新思路。