五子衍宗丸的藥效挖掘及斑馬魚實驗驗證

趙晨,楊怡雯,王洪平,彭平,尹瓊,肖婷婷,徐懿喬

(1.北京同仁堂股份有限公司科學研究所,北京 100079;2.杭州環特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

五子衍宗丸由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子組成[1],為中醫補腎固精助腎陽的經典方。五子衍宗丸本為補腎填精所設,在中醫辨證論治觀與“異病同治”思想的指導下,凡是腎虛精虧之證均可采用五子衍宗丸治療[2]。

斑馬魚既具有細胞等體外實驗用藥量少、實驗費用低、周期短、高通量等特點,又具備整體動物實驗可觀察多個器官、評價藥效學、藥動學以及可評價代謝物活性等優勢[3]。目前基于已知疾病機制而建立的斑馬魚模型在生物醫學的諸多領域快速發展,也應用于心血管疾病、神經系統疾病、糖尿病、視網膜疾病、感染性疾病、骨質疏松等諸多臨床常見病,并在抗癌、抗血栓與止血等領域得到應用[4]。本研究應用計算二次開發的方法和生物驗證相結合,研究藥物與疾病的關聯并利用斑馬魚模型加以驗證,挖掘五子衍宗丸潛在的適應證。

1 材料與方法

1.1 儀器AZ100電動聚焦連續變倍熒光顯微鏡(Nikon公司);ACCU-CHEK Performa血糖儀(羅氏診斷產品有限公司);TG16G高速離心機(上海依赫生物科技有限公司);Zebra Lab 3.11行為分析儀(ViewPoint公司)。

1.2 試劑與試藥五子衍宗丸(同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠);鹽酸吡格列酮片(江蘇德源藥業股份有限公司);磷酸西格列汀片(Merck Sharp &Dohme Italia SPA);純蛋黃粉(浙江艾格生物科技股份有限公司);血糖儀試紙(羅氏診斷產品有限公司);葡萄糖、結晶氯化鋰、甲基纖維素、六水氯化鋁均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酰膽堿酯酶檢測試劑盒(AAT Bioquest公司)。

1.3 動物斑馬魚均飼養于28 ℃的養魚用水中(水質:每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽,電導率為450～550 μS·cm-1;pH為6.5～8.5)。野生型AB品系斑馬魚、轉基因運動神經元綠色熒光NBT品系斑馬魚、轉基因中性粒細胞熒光斑馬魚品系與外周運動神經綠色熒光斑馬魚雜交品系斑馬魚,各品系斑馬魚以自然成對交配方式進行繁殖。

1.4 五子衍宗丸藥效作用挖掘

1.4.1 五子衍宗丸化學成分及靶點的收集借助BATMAN-TCM平臺(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),篩選條件為Score cutoff≥20,P-value cutoff<0.05,收集枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子的成分及靶點。

1.4.2 靶點的組織特異性將相關靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),使用作用部位分析功能,富集靶點作用的組織[5]。

1.4.3 藥物-疾病通路關聯分析使用DAVID平臺的GAD_DISEASE子庫、R:enrichDGN包進行疾病富集分析,選擇P值小于0.01極其顯著富集的疾病作為分析的目標。選擇前10種疾病進行通路譜關聯性分析,為了獲得可信度較高的數據,使用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)平臺檢索疾病并獲得靶點,取兩個平臺的并集作為疾病靶點,使用R語言對靶點進行KEGG通路富集。使用R語言對五子衍宗丸的靶點進行KEGG通路富集。選取富集的P值不大于0.01的通路計算藥物-疾病的關聯性[6]。

1.5 斑馬魚的藥效驗證

1.5.1 防治阿爾茨海默病藥效試驗

1.5.1.1 模型的制備、分組與給藥采用水溶給予六水氯化鋁建立斑馬魚阿爾茲海默病模型。隨機分為正常組、模型對照組、陽性對照組和五子衍宗丸組,每組30尾,給藥組分別水溶暴露給予相應受試藥物。陽性藥為鹽酸多奈哌齊(3.33 μg·mL-1)。

1.5.1.2 反應能力恢復以及運動功能障礙恢復評價隨機選取4 dpf野生型AB品系斑馬魚,28 ℃處理24 h后,每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚,以光暗刺激下斑馬魚的每分鐘平均運動速度的統計學分析結果評價五子衍宗丸反應能力恢復作用,以斑馬魚的運動距離的統計學分析結果評價五子衍宗丸運動功能障礙恢復作用。

1.5.1.3 乙酰膽堿酯酶抑制作用隨機選取4 dpf野生型AB品系斑馬魚,28 ℃處理48 h后,采用乙酰膽堿酯酶測定試劑盒,利用多功能酶標儀采集數據,以斑馬魚體內乙酰膽堿酯酶熒光值的統計學分析結果評價樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制作用。

1.5.2 降糖藥效試驗

1.5.2.1 模型的制備、分組與給藥采用白天給予1.5 mg·mL-1的水溶蛋黃粉溶液,晚上給予30 mg·mL-1的水溶葡萄糖溶液,建立斑馬魚高血糖模型。隨機分為正常組、模型對照組、陽性對照組和五子衍宗丸組,每組30尾,給藥組分別水溶暴露給予相應受試藥物。血糖水平評價的陽性藥為鹽酸吡格列酮(20.0 μg·mL-1),周圍神經保護功效及周圍神經炎癥消退功效評價的陽性藥為磷酸西格列汀(350 μg·mL-1)。

1.5.2.2 對葡萄糖水平的影響隨機選取5 dpf野生型AB品系斑馬魚,28 ℃處理48 h后,用水將斑馬魚清洗3遍,用血糖儀檢測斑馬魚整體葡萄糖水平。

1.5.2.3 周圍神經保護功效評價隨機選取5 dpf轉基因運動神經元綠色熒光NBT品系斑馬魚,28 ℃處理4 d后,每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照,以斑馬魚神經熒光強度的統計學分析結果評價五子衍宗丸周圍神經保護功效。

1.5.2.4 周圍神經炎癥消退功效評價隨機選取5 dpf轉基因中性粒細胞熒光斑馬魚品系與外周運動神經綠色熒光斑馬魚雜交品系斑馬魚,28 ℃處理4 d后,每組隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照,以斑馬魚神經周圍中性粒細胞數量的統計學分析結果評價五子衍宗丸周圍神經炎癥消退功效。

1.6 數據分析統計學處理結果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0軟件進行統計學分析,P<0.05表明差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 五子衍宗丸藥效作用挖掘

2.1.1 化學成分及靶點收集借助BATMAN-TCM平臺,收集枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子的成分及靶點,去除重復值,得到相關成分118個,相關靶點1 441個。

2.1.2 靶點的組織特異性如圖1所示,使用DAVID數據庫組織定位功能,可知靶點作用部位可能與神經系統、生殖、代謝、癌癥以及腎臟功能等相關。

圖1 疾病分類富集結果

2.1.3 藥物-疾病通路關聯分析如圖2所示,使用DAVID平臺的GAD_DISEASE子庫、R:enrichDGN包進行疾病富集分析,選擇P值小于0.01極其顯著富集的疾病作為分析的目標。選擇糖尿病等10種疾病進行通路譜關聯性分析,藥物-疾病通路關聯的原理為假定當藥物和疾病對相同的通路都有顯著的影響時,藥物對該疾病可能存在著調節作用,基于這個假設來計算藥物與疾病的關聯性。使用GeneCards數據庫和DisGeNET數據庫平臺檢索疾病并獲得靶點,使用R語言對靶點進行KEGG通路富集。使用R語言對五子衍宗丸的靶點進行KEGG通路富集。選取富集的P值不大于0.01的通路計算藥物-疾病的關聯性。結果顯示,糖尿病和阿爾茨海默病在2個平臺富集均能排進前10位,阿爾茨海默病評分為2.37,而糖尿病評分為2.02。確定阿爾茨海默病和糖尿病為五子衍宗丸的潛在研究方向。

圖2 GAD_DISEASE疾病富集(A)和R語言疾病富集(B)

2.2 藥效學驗證

2.2.1 防治阿爾茨海默病效果評價如圖3所示,六水氯化鋁處理斑馬魚后,光暗刺激下斑馬魚的每分鐘平均運動速度、斑馬魚的運動距離均下降,與模型對照組比較,陽性對照組和五子衍宗丸組可以提高斑馬魚的反應速度和運動距離,表明五子衍宗丸可以改善反應能力,恢復運動功能障礙。如圖4所示,分析不同處理組斑馬魚體內乙酰膽堿酯酶熒光值,五子衍宗丸低、中濃度與模型對照組差異不顯著,高濃度組可顯著降低乙酰膽堿酯酶水平,表明五子衍宗丸可能通過抑制乙酰膽堿酯酶活性達到防治阿爾茲海默病的功效。

圖3 五子衍宗丸對斑馬魚每分鐘光暗速度差值和運動距離的影響

圖4 五子衍宗丸對乙酰膽堿酯酶(AchE)水平的影響

2.2.2 降糖效果評價如表1所示,蛋黃粉和葡萄糖處理斑馬魚后,葡萄糖水平明顯升高,表明造模成功,陽性對照組和五子衍宗丸組均可降低斑馬魚葡萄糖水平。

表1 五子衍宗丸對葡萄糖水平的影響

糖尿病神經病變是糖尿病最常見的慢性并發癥,病程10年以上患者易出現明顯的神經病變臨床表現[7]。如圖5所示,隨機選取10尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照,統計斑馬魚神經熒光強度和神經周圍中性粒細胞數量。在轉基因運動神經元綠色熒光NBT品系中,模型對照組神經熒光強度降低,五子衍宗丸組神經熒光強度較模型對照組增強,表明五子衍宗丸具有保護周圍神經的功效。在轉基因中性粒細胞熒光斑馬魚品系與外周運動神經綠色熒光斑馬魚雜交品系中,模型對照組神經周圍中性粒細胞數量增強,五子衍宗丸組神經周圍中性粒細胞數量較模型對照組降低,表明五子衍宗丸具有消退周圍神經炎癥的功效。

A.斑馬魚神經熒光強度典型圖;B.斑馬魚神經周圍中性粒細胞典型圖;C.五子衍宗丸處理后斑馬魚神經熒光強度;D.五子衍宗丸處理后斑馬魚神經周圍中性粒細胞數量

3 討論與結論

五子衍宗丸由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子組成,五子衍宗丸本為補腎填精所設,在中醫辨證論治觀與“異病同治”思想的指導下,凡是腎虛精虧之證均可采用五子衍宗丸進行借鑒治療[7]。本研究通過數據分析及其實驗驗證,探討其在糖尿病和阿爾茨海默病的藥效學作用,以期更好地指導臨床應用,為今后進一步研究五子衍宗丸的應用提供思路。

3.1 五子衍宗丸與糖尿病臨床研究報道表明,五子衍宗丸常和西藥聯合使用治療糖尿病性勃起功能障礙或糖尿病腎病。糖尿病性勃起功能障礙是糖尿病常見并發癥[8],五子衍宗丸聯合十一酸睪酮膠丸治療男性2型糖尿病合并遲發性性腺功能減退癥療效顯著[9]。在西醫常規治療基礎上加用五子衍宗丸加味方治療脾腎虧虛兼瘀證Ⅲ期糖尿病腎病療效優于單純西醫常規治療,在調整機體的功能狀態,恢復機體正氣等方面也有顯著療效[10]。動物體內研究表明,五子衍宗丸加減方可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖,促使機體恢復血糖穩態的作用,作用可能與miR-375基因調節與胰島保護有關[11]。五子衍宗丸能減輕D-半乳糖所致的氧化損傷,抑制糖尿病性白內障小鼠晶狀體組織多元醇通路的異常活躍,從而改善糖尿病性白內障小鼠晶狀體的混濁程度[12]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖具有降低血糖,增加胰島素分泌的功效[13],菟絲子多糖能改善糖尿病大鼠糖脂代謝[14],覆盆子酮具有增加胰島素分泌,降血糖效果[15]。車前子總苷對小鼠原代胰島細胞及RINm5F胰島瘤細胞胰島損傷模型均具有治療保護作用[16]。

3.2 五子衍宗丸與阿爾茨海默病古醫籍有云,“腎精不足,則志氣衰,不能上通于心,故迷惑善忘也。”阿爾茨海默病是一種中樞神經退行性疾病,在中醫“腎生髓,腦為髓?！钡睦碚撝笇?常采用補腎生髓法防治癡呆[17]。采用五子衍宗顆粒治療輕度認知障礙患者,治療組記憶指數升高[18]。五子衍宗液可以顯著改善腎虛老年男性患者腦功能,提高其瞬時記憶及邏輯故事分節記憶[19]。應用加味五子衍宗顆粒治療輕度認知障礙患者,治療組的記憶商均較治療前明顯提高,海馬指數和顳角寬度較治療前明顯變小[20]。動物體內研究表明,采用阿爾茨海默病(AD)小鼠模型,通過Morris水迷宮定位航行試驗,證明加味五子衍宗顆粒及其總黃酮、總多糖能改善AD模型小鼠的空間學習記憶能力[21]。加味五子衍宗方及有效組分能改善東莨菪堿所致記憶獲得障礙模型動物的空間學習記憶成績,對中樞膽堿能系統損傷的學習記憶障礙有保護作用[22]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖能增強老年癡呆大鼠的學習和記憶功能[23],菟絲子總黃酮可增強神經元的可塑性和營養性,以防止神經細胞從內源性線粒體途徑丟失或凋亡,進而改善內分泌衰退型癡呆小鼠的學習記憶能力[24]。五味子醇甲可通過減輕腦組織神經元變性、脫失,改善突觸功能等途徑起到防治老年性癡呆的作用[25]。

3.3 斑馬魚在糖尿病及阿爾茨海默病研究中的特點斑馬魚是僅次于小鼠的第二大模型生物,和哺乳動物有著相似生物結構和功能,因其具有體積小、養殖成本低、易飼養、發育快速、繁殖力強、便于觀察等優勢,廣泛應用于醫藥研究領域[26]。斑馬魚與代謝調控相關的主要器官,如胰腺及胰島素敏感的外周組織與人類相似,使得斑馬魚可以作為糖代謝的研究模型[27]。斑馬魚表現出的學習、睡覺、藥物成癮和神經保護表型也與人類相似[28],因此斑馬魚也是神經藥物篩選的良好模式生物。本研究借助數據挖掘技術,建立了基于斑馬魚模型的“二次開發-活性評價”的方法,對五子衍宗丸降血糖和防治阿爾茨海默病的藥效進行了評估,使數據挖掘與實驗結合,有效節約實驗時間,降低實驗成本。

本研究利用計算二次開發的方法和斑馬魚活體試驗結合的方法,發現五子衍宗丸可能對神經系統和代謝疾病產生影響。斑馬魚降糖藥效試驗表明,五子衍宗丸可以降低斑馬魚葡萄糖水平并改善糖尿病神經病變。防治阿爾茨海默病藥效試驗表明,五子衍宗丸可以改善斑馬魚反應能力,恢復運動功能,可能與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關。