基于Rho/Rock通路研究麝香心痛寧抗大鼠血管損傷后內(nèi)膜增生的機制研究

于凌群,高偉萍,史明仟,辛新,王萌媛,曹桂云,楊瑩

(1.山東中醫(yī)藥大學,山東 濟南 250355;2.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司,山東 濟南 250103)

目前,心腦血管疾病發(fā)病率、致死率均居疾病首位,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病發(fā)病最重要的一個病理生理基礎[1]。對于存在血管狹窄等嚴重威脅生命的AS患者,臨床治療手段包括血管成形術(shù)、支架植入、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)等。PCI是目前非常有效的治療手段,但手術(shù)過程損傷血管,極易導致術(shù)后血管內(nèi)膜增生,引起繼發(fā)性的血管再狹窄及支架內(nèi)血栓形成等問題。腹主動脈球囊損傷術(shù)所導致的血管內(nèi)皮剝落和平滑肌細胞增生,與人類PCI術(shù)所引起冠脈狹窄的病理變化過程相似,可模擬人類PCI術(shù)血管內(nèi)膜增生病變過程[2]。

研究表明,Rho/Rock信號通路在血管損傷后內(nèi)膜增生的發(fā)生過程中有著重要的作用。AS發(fā)生過程中,血管Rock表達異常升高,可促進激活NF-κB通路,導致炎癥因子的積聚,進而引起血管損傷后新生內(nèi)膜的增生[3]。抑制Rho/Rock信號通路可起到保護血管內(nèi)皮的作用,維持血管穩(wěn)態(tài)。Rho/Rock信號通路在增強膽固醇攝取和泡沫細胞形成中也發(fā)揮了重要的作用[4]。麝香心痛寧由延胡索、川芎、人參、麝香、蘇合香、冰片六味中藥組成,具有行氣開竅、活血化瘀、通絡止痛之功效,用于治療胸痹,冠心病氣滯血瘀證者[5]。麝香心痛寧能否抑制血管損傷后內(nèi)膜增生還未見報道,本研究建立腹主動脈球囊損傷大鼠模型觀察麝香心痛寧的藥理作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取健康成年雄性SD大鼠30只,體重260～280 g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供,實驗動物使用許可證號:SCXK(魯)2022 0006,實驗動物倫理號:SDUTCM20201030002,飼養(yǎng)條件:溫度為(23±1)℃,相對濕度為60%～70%,光/暗周期為12 h。

1.2 試劑與儀器麝香心痛寧(山東宏濟堂藥業(yè)集團有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(山東思科捷生物技術(shù)有限公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒10%(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);顯影液、TBST(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PBS(Biosharp公司);抗體(Abcam公司)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中山金橋生物科技有限公司);4%多聚甲醛緩沖液(Biosharp公司);酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司);化學試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

正置光學顯微鏡(Nikon 公司); 酶標儀(德國Thermo Scientific 公司);GE Amersham Imager 600多色熒光成像系統(tǒng)(GE Healthcare公司);LightCycler 480II 實時熒光定量 PCR儀(Roche公司)。

1.3 模型制備及分組給藥取健康成年SD大鼠30只,隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、麝香心痛寧(200 mg·kg-1)組。大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h后稱重,腹腔注射3%的戊巴比妥,麻醉后于頸部正中做切口進行手術(shù)操作。正中縱向做3 cm左右切口,鈍性分離皮下組織。模型對照組及麝香心痛寧組,分離大鼠的左側(cè)頸動脈,并用外科縫合線將其頸總動脈血管遠心端結(jié)扎,用眼科剪在血管近心端剪開一個V形創(chuàng)口,將浸潤過酒精、肝素的球囊(2.00 mm × 12.00 mm)從V形創(chuàng)口送至腹主動脈(送入深度約8 cm)。將5 mL注射器注入肝素充盈球囊并回拉旋轉(zhuǎn)球囊導管至左頸總動脈處,將球囊抽至負壓再送入血管,反復緩慢牽拉球囊3次。確保血管損傷后,拉出球囊,結(jié)扎頸動脈,清洗手術(shù)創(chuàng)口后縫合。假手術(shù)組只進行左側(cè)頸總動脈血管的分離,用外科手術(shù)縫合線結(jié)扎,并不用球囊進行血管內(nèi)部損傷。麝香心痛寧組大鼠灌胃給予200 mg·kg-1的藥物,10 mL·kg-1,每天1次,連續(xù)14 d。模型對照組和假手術(shù)組同法給予等容積的生理鹽水。大鼠于末次給藥12 h 后,處死,下腔靜脈取血,分離腹主動脈,取兩厘米長腹主動脈置于4%多聚甲醛溶液,剩余血管及器官組織置于-80 ℃ 冰箱保存。

1.4 指標檢測

1.4.1 大鼠血管組織HE染色大鼠腹主動脈血管組織石蠟包埋、切片后進行HE染色,隨后置于光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.4.2 大鼠血清SOD、MDA、MCP-1及GSH-Px含量檢測用化學試劑盒測定血清氧化相關(guān)標記物SOD、MDA、MCP-1、GSH-Px含量。

1.4.3 ELISA法檢測大鼠血管組織NO、ET-1、VEGF和IL-1β的含量采用雙抗體夾板法測定血管組織相關(guān)因子的濃度。

1.4.4 實時熒光定量PCR取存于-80 ℃冰箱的血管組織,Trizol抽提總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,按SYBR Green PCR 試劑盒,以β-actin為內(nèi)參,檢測大鼠血管組織中相關(guān)因子的mRNA水平。

1.4.5 Western blotting取大鼠血管,PBS漂洗后剪成小塊加入蛋白裂解液,冰浴后勻漿器勻漿,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min,取上清液,使用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。制膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h,加入一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗5遍5 min后加入山羊抗兔IgG,室溫孵育30 min;加入顯影液,觀察條帶并拍照。

2 結(jié)果

2.1 麝香心痛寧對主動脈血管內(nèi)膜損傷的影響假手術(shù)組大鼠腹主動脈血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)基本正常。模型對照組大鼠腹主動脈血管部分部位彈力變?nèi)跚夜鼙谠龊?內(nèi)膜血管平滑肌細胞增多,中膜血管平滑肌細胞排列紊亂,血管管腔呈向心或偏心性狹窄。麝香心痛寧組大鼠腹主動脈血管內(nèi)皮剝脫,內(nèi)膜增生等病理現(xiàn)象均有改善(見圖1)。

圖1 麝香心痛寧(SXN)對主動脈血管內(nèi)膜的影響

2.2 麝香心痛寧對大鼠體重的影響與模型對照組相比較,麝香心痛寧給藥1、2周后大鼠體重無統(tǒng)計學差異。

2.3 麝香心痛寧對大鼠血清相關(guān)指標的影響與假手術(shù)組相比,模型對照組大鼠血清中SOD和GSH-Px下降,而MDA和MCP-1增加(P<0.05)。與模型對照組相比,麝香心痛寧可增加SOD和GSH-Px的含量,而降低MDA和MCP-1的含量(P<0.05),差別有統(tǒng)計學意義。

2.4 麝香心痛寧對大鼠血管組織相關(guān)指標的影響與假手術(shù)組相比,模型對照組大鼠腹主動脈血管組織NO含量下降,而ET-1、VEGF 及IL-1β增加(P<0.05)。與模型對照組相比,麝香心痛寧可增加NO的含量,而降低ET-1、VEGF 及IL-1β的含量(P<0.05),差別有統(tǒng)計學意義。

2.5 麝香心痛寧對大鼠血管組織Rho/ROCK通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達的影響與假手術(shù)組相比,模型對照組大鼠腹主動脈血管組織Rock1、Rock2和Rho的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。與模型對照組相比,麝香心痛寧可降低Rock1、Rock2和Rho的mRNA和蛋白的表達(P<0.05),差別有統(tǒng)計學意義(見圖2)

A.qPCR法檢測Rock1、Rock2和Rho mRNA的表達;B～C.WB法檢測Rock1、Rock2和Rho蛋白的表達

3 討論

PCI術(shù)和冠狀動脈搭橋等都是治療冠心病的主要手段,而術(shù)后支架內(nèi)再狹窄也是導致心血管事件發(fā)生率升高的主要因素。血管內(nèi)膜炎性細胞浸潤、內(nèi)皮細胞增生、血管平滑肌(VSMC)遷移至內(nèi)膜等導致內(nèi)膜增厚,是管腔狹窄的主導因素,因而如何抑制血管內(nèi)膜增厚、防止血管發(fā)生再狹窄是心血管疾病的研究熱點之一[6]。目前臨床上用于PCI 術(shù)的藥物主要有雷帕霉素、紫杉醇等。此類藥物阻止損傷部位血管平滑肌增殖遷移的同時,也會干預損傷血管內(nèi)皮化,這就會引起血管遲發(fā)性再狹窄以及遲發(fā)性血栓的生成,導致PCI術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生。因此尋找安全有效的治療血管再狹窄藥物,具有重要的臨床研究意義。

研究發(fā)現(xiàn)[7]大鼠球囊損傷后24 h可引起VSMC增殖、遷移,14 d后內(nèi)膜增生達到最高峰;21 d模型對照組內(nèi)膜呈進行性彌漫性增厚,其中以平滑肌為主,中膜細胞排列紊亂,管腔面積明顯縮小。本研究建立大鼠腹主動脈球囊損傷術(shù)模型發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組管壁結(jié)構(gòu)完整,血管內(nèi)膜呈現(xiàn)良好的連續(xù)性,中膜邊緣可見VSMCs規(guī)則排列。模型對照組大鼠與假手術(shù)組相比,大鼠主動脈血管內(nèi)皮剝落,內(nèi)膜明顯增厚,血管腔變窄。麝香心痛寧組大鼠腹主動脈內(nèi)皮剝脫、內(nèi)膜增厚、血管平滑肌遷移等病理現(xiàn)象減少,表明麝香心痛寧可抑制腹主動脈球囊損傷大鼠血管內(nèi)膜增生。

NO、ET-1和VEGF是反映血管內(nèi)皮功能的因子,NO具有舒張血管平滑肌,抑制炎癥因子和血小板黏附于血管的作用,ET-1 可促進血管平滑肌細胞增殖,并收縮血管,VEGF可促進內(nèi)皮細胞的遷移和增殖[8]。麝香心痛寧可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮相關(guān)因子的含量[9],從而抑制內(nèi)膜增生的發(fā)展進程。通過檢測大鼠血管炎癥相關(guān)因子IL-1β表達發(fā)現(xiàn)麝香心痛寧可降低IL-1β表達。此外,麝香心痛寧可抑制Rho/Rock通路相關(guān)因子的表達。綜上所述,麝香心痛寧具有保護血管內(nèi)膜、抑制內(nèi)膜增生的作用,并具有抗氧化損傷和抗炎作用。麝香心痛寧抑制血管損傷后內(nèi)膜增生的藥理作用機制可能與其抑制Rho/Rock信號通路相關(guān)。