UPLC-Q-Orbitrap-MS快速分析水紅花子的化學(xué)成分

邊星,夏林波,鄧仕任,孫璐,楊浩

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600)

水紅花子為蓼科(Polygonaceae)蓼屬植物紅蓼(PolygounumorientaleL.)的干燥成熟果實,別名水葒子、葒草實,性寒、味咸,具有散血消淤、消積止痛之功能,自1977年以來收載于歷版《中國藥典》中,為臨床常用中藥[1]。目前,已從水紅花子中鑒定出40余種化學(xué)成分[2-4],主要集中在黃酮類(如花旗松素、槲皮素、葒草素等)、酰胺類(對香豆酰酪胺、對阿魏酰酪胺等)、鞣質(zhì)類(二甲基鞣花酸、沒食子酸等)、脂肪酸類(亞油酸、壬酸等),但對水紅花子化學(xué)成分的系統(tǒng)研究尚顯不足,有必要對水紅花子開展全面的成分分析研究。超高效液相串聯(lián)四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術(shù)具有高靈敏度、高通用性及高分辨率的特點,已經(jīng)成為中藥復(fù)雜成分分析研究中強有力的工具,已廣泛用于中藥成分定性分析[5]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對水紅花子提取物的化學(xué)成分進(jìn)行全面深入的分析,為闡明水紅花子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器QExactive plus四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Dionex公司);數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Xcalibur 4.1工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司);ME 204E十萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Direct-Q5型超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 試藥水紅花子購買自亳州典世堂藥業(yè)銷售有限公司,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王添敏教授鑒定為蓼科植物紅蓼(PolygonumonrientaleL.)的干燥成熟果實,標(biāo)本存放于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。阿魏酸、槲皮素、蘆丁、小檗堿等對照品購自四川維克奇生物科技有限公司,純度均大于98.5%。甲醇和乙腈為色譜純;甲酸為質(zhì)譜純(美國Tedia公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 供試品溶液的制備水紅花子藥材干燥后粉碎,精密稱取粉末(過三號篩)1.00 g,加甲醇10 mL,浸泡1 h,再超聲提取(功率 250 W,頻率40 kHz)1 h,放冷,提取液4 000 r·min-1離心10 min,取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.2 對照品溶液的制備取阿魏酸、槲皮素、蘆丁、小檗堿對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL各含 5 μg的混合溶液,即得。

2.3 色譜條件色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A相為含0.1%的甲酸水,B相為含0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脫條件:0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～21 min,99% B。柱溫:40 ℃,流速:0.2 mL·min-1,進(jìn)樣量:3 μL。

2.4 質(zhì)譜條件HESI離子源;離子源溫度:200 ℃;正、負(fù)離子掃描模式;電離源電壓4 KV;毛細(xì)管溫度320 ℃;透鏡電壓110 V;鞘氣和輔助氣為高純氮氣(純度>99.99%),鞘氣流速40 arb,輔助氣流速10 arb;MS1為全掃描模式,掃描范圍:50～1 250 m/z,分辨率:60 000;MS2采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(DDA),選擇MS1中最強10個離子進(jìn)行掃描;裂解方式:CID;裂解能量:35 eV。

3 結(jié)果

在“2.3”和“2.4”項下的檢測條件下,得到水紅花子甲醇提取物正、負(fù)離子模式下的基峰圖(見圖1)。通過Xcalibur 4.1軟件查看質(zhì)譜數(shù)據(jù),結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)、質(zhì)譜庫數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的對比分析,共從水紅花子中鑒定出54個化學(xué)成分,詳細(xì)信息見表1。結(jié)果表明,水紅花子成分復(fù)雜,種類較多,鑒定出的成分包括21個黃酮(黃酮醇)及其糖苷、6個酚酸、5個氨基酸、4個生物堿、4個脂肪酸及其酯、3個二氫黃酮、3個核苷、3個鞣質(zhì)和5個其他類成分。

表1 水紅花子的UPLC-Q-Orbitrap-MS鑒定結(jié)果

A.為正離子模式;B.為負(fù)離子模式

其中,小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素、3-O-對香豆?；鼘幩帷⒑邴湶輧?nèi)酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、異亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鳥苷、壬二酸、壬二酸單甘油酯、2-亞麻酰基-rac-甘油等15種化合物為首次從水紅花子中鑒定得到。

3.1 黃酮苷類同分異構(gòu)體的鑒定水紅花子中富含黃酮碳苷和黃酮氧苷等兩類黃酮單糖苷,其中有多組同分異構(gòu)體。借助于Orbitrap高分辨的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),可以根據(jù)離子裂解特征對上述同分異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分。負(fù)離子模式下,黃酮碳苷主要通過糖基的環(huán)裂解產(chǎn)生一系列穩(wěn)定的特征二級離子碎片,如[M-H-120 Da]-和[M-H-90 Da]-等,而黃酮氧苷則易通過糖基的整體丟失形成相應(yīng)的苷元基峰碎片,如[M-H-146 Da]-等[8-10]。以化合物14、16、26為例介紹其鑒定過程。一級質(zhì)譜中,3個化合物[M+H]+均為449.105,[M-H]-均為447.092,推斷分子式均為C21H20O11,為同分異構(gòu)體。負(fù)離子模式下,化合物14的二級質(zhì)譜[如圖2(A)]所示,其中豐度最強的碎片離子為m/z 357.061 7([M-H-90 Da]-),碎片特點符合碳苷己糖六元環(huán)0,3鍵開環(huán)裂解,為丟失C3H6O3后所產(chǎn)生的穩(wěn)定的[0,3X0-H]-離子,此外還可見碎片離子m/z 327.051 2([M-H-120 Da]-),429.083 0([M-H-18 Da]-),285.040 7([M-H-162 Da]-),分別對應(yīng)為[0,2X0-H]-、[M-H-H2O]-和[M-H-Glc]-離子。上述二級質(zhì)譜信息與黃酮己糖碳苷的裂解規(guī)律相符,結(jié)合文獻(xiàn)報道推斷化合物14為“異葒草素”。化合物26的二級質(zhì)譜[如圖2(B)所示]與化合物14的完全不同:該化合物主要產(chǎn)生m/z 301.035 1([M-Glc]-)和300.0285([M-H-Glc]-·)兩種碎片離子,符合黃酮己糖氧苷的Y裂解(即脫去糖基而保留羥基)方式[11-12],結(jié)合文獻(xiàn)報道推斷化合物26為“槲皮苷”?；衔?4和26的質(zhì)譜裂解途徑如圖2所示。值得一提的是,化合物16的二級質(zhì)譜與化合物14的十分類似,二者間的區(qū)別僅為化合物16中m/z 429.083 0([M-H-H2O]-)碎片的相對豐度較低(約為化合物14的1/5),由此推斷化合物16中的己糖存在于C-8位[10,13],化合物16鑒定為“葒草素”。

A.為異葒草素;B.為槲皮苷

3.2 多甲氧基黃酮的鑒定從水紅花子提取物中共鑒定出9種多甲氧基黃酮,該類化合物為水紅花子的特征藥效成分。多甲氧基黃酮易在正離子模式下檢測,在二級質(zhì)譜中常丟失一個到多個CH3·,產(chǎn)生一系列[M+H-15n]+的強峰,同時還伴隨著C=O和H2O的中性丟失。現(xiàn)以化合物49為例介紹鑒定過程。一級質(zhì)譜中,該化合物的[M+H]+為463.156 8,推斷分子式為C23H26O10。二級質(zhì)譜中,可以觀察到碎片離子m/z 448.136 6([M+H-15]+)、433.113 3([M+H-15-15]+)、430.127 4([M+H-15-18]+)、402.131 8([M+H-15-18-28]+)、415.103 5([M+H-15-15-18]+),為母離子經(jīng)一系列脫甲基、脫水、脫羰基之后產(chǎn)生的碎片峰,符合多甲氧基黃酮的質(zhì)譜裂解規(guī)律[14]。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對確定化合物49為“exoticin”,一種八甲氧基黃酮,其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解過程見圖3。

圖3 Exoticin的二級質(zhì)譜和質(zhì)譜裂解途徑

3.3 小檗堿的鑒定本文從水紅花子中首次鑒定出小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素等15種化學(xué)成分,均是通過與MassBank、mzCloud等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫或?qū)φ掌废啾葘Χ刚J(rèn)的,下面以化合物35為例進(jìn)行介紹。一級質(zhì)譜中,該化合物的[M]+為366.121 6,推斷分子式為C20H18NO4+。二級質(zhì)譜中,可以觀察到碎片離子m/z 321.099 5([M-15]+ ·)、306.076 5([M-15-15]+),為母離子分別丟失一個和兩個甲基所產(chǎn)生的碎片離子,同時還可以觀察到m/z 320.092 3([M-15-1]+·)、292.097 1([M-15-1-28]+),為[M-CH3]+·經(jīng)一系列脫氫、脫羰基所形成[15]。經(jīng)與MZCloud數(shù)據(jù)庫和對照品比對確定化合物35為小檗堿,其二級質(zhì)譜圖及可能的裂解過程見圖4。

A.為樣品;B.為對照品

4 討論

本文利用UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)對水紅花子提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,共鑒定出包括黃酮類、酚酸類、生物堿類等54種化學(xué)成分,其中小檗堿、四氫帕馬丁、甜橙黃酮、5-O-去甲川陳皮素、3-O-對香豆?；鼘幩?、黑麥草內(nèi)酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、異亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鳥苷、壬二酸、壬二酸單甘油酯、2-亞麻?；?rac-甘油等15種成分為首次從水紅花子中鑒定得到,也是首次從藥用植物紅蓼中鑒定得到。本文以異葒草素、葒草素、槲皮苷的鑒定過程為例,闡述了同分異構(gòu)體的質(zhì)譜解析過程;以小檗堿為例描述了新發(fā)現(xiàn)化合物的鑒定方法;還首次報道了水紅花子中的特征性成分-exoticin(1種八甲氧基黃酮)的質(zhì)譜裂解規(guī)律。上述結(jié)果表明,Orbitrap技術(shù)具有超高質(zhì)譜分辨率和超高質(zhì)量精度的優(yōu)勢,可以快速可靠地識別和鑒定多種化合物,適用于中藥等復(fù)雜體系中的化學(xué)成分分析研究。本研究可為水紅花子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。