基于臨床指標-CT征象的列線圖模型術前預測結直腸癌微衛星不穩定狀態

卞雪蓮,孫琦,王咪,董瀚韻,戴曉曉,吳永友,張力元,范國華,陳光強

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)目前是全球發病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤,且呈現增長趨勢[1]。微衛星不穩定(microsatellite instability,MSI)是CRC致癌途徑相關的分子機制之一,具有特殊的臨床意義:首先,MSI檢測可作為林奇綜合征(Lynch syndrome,LS)的初篩方法;其次,對于早期CRC,尤其是II期病變,MSI狀態是一個積極的預后因素;最后,MSI狀態的CRC患者可獲益于免疫治療,但不能從以氟尿嘧啶為基礎藥物的化療方案中獲益[2]。所以檢測MSI狀態對指導CRC患者的診療具有一定的臨床價值。

MSI檢測通常采用有創的方法(如活檢)來獲取腫瘤的病理組織,耗時長、花費大且技術要求高,而且活檢只能獲取病灶極小部分的樣本,難以全面反映腫瘤的微衛星狀態[3]。所以,臨床上更希望有一種無創的、經濟有效的術前預測CRC患者腫瘤MSI狀態的方法。CT增強掃描是臨床上常用的一種診斷CRC的無創性檢查方法,能夠判斷病灶局部及全身情況,有助于疾病診斷及治療方案的選擇。因此,本研究中通過分析基于CT增強征象聯合臨床指標建立的列線圖模型在術前預測CRC患者MSI狀態中的可行性,旨在術前無創性預測CRC的MSI狀態,從而有助于CRC患者的診療及預后評估。

材料與方法

1.研究對象

回顧性連續搜集2016年1月-2022年12月在本院就診且符合本研究中納入標準的504例CRC患者的病例資料。納入標準:①經手術病理證實為結直腸腺癌;②術前2周內接受Philips 256 CT機腹盆部平掃及三期(動脈期、靜脈期、延遲期)增強檢查;③采用免疫組化方法獲得了MSI或微衛星穩定(microsa-tellite stability,MSS)狀態的結果。排除標準:①臨床資料不完整(n=24);②CT圖像上無法識別腫瘤或圖像質量不佳(n=53);③病理證實為非結腸腺癌或合并其它癌(n=39);④術前接受過放療、化療和生物治療等任何抗癌治療(n=30);⑤出現腸套疊、腸穿孔等并發癥(n=11)。

最終,共納入符合要求的347例患者(MSI組71例,MSS組276例),按照7︰3的比例隨機分為訓練集243例(MSI組50例、MSS組193例)和驗證集104例(MSI組21例、MSS組83例)。

本研究經本院倫理委員會批準。

2.臨床資料

通過回顧CRC患者的電子病例,搜集術前1周內的臨床信息,包括一般信息:年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史、高血壓史和糖尿病史;記錄各項實驗室指標的值,包括血清癌胚抗原(CEA)、血清糖類抗原19-9(CA199)、白細胞(WBC)、中性粒細胞(NE)、淋巴細胞(LYM)、血小板(PLT)、C反應蛋白(CRP)和白蛋白(ALB),并計算中性粒細胞與淋巴細胞計數的比值(NLR=NE/LYM)及系統免疫炎癥指數值[SII=PLT×(NE/LYM)]。

3.CT圖像采集和分析

使用Philips 256 CT機進行腹部和盆腔CT平掃和三期增強掃描。檢查前患者禁食8 h以上,掃描前約2 h口服陰性對比劑(0.9%生理鹽水400 mL+20%甘露醇100 mL),總量約1500 mL。CT掃描參數:管電壓120 kV,管電流自動調制技術(150～500 mA),探測器寬度128×0.625 mm,螺距0.99,層厚5 mm,層間距5 mm,0.75 s/r,視野250 mm×250 mm,矩陣512×512。腹盆部CT平掃后,注射80～100 mL碘海醇(300 mg I/mL),注射流率3.0～4.0 mL/s,分別于給藥后25～35、65～80及210 s啟動動脈期、門靜脈期及延遲期增強掃描。

所有患者CT圖像由一位具有3年以上腹部影像診斷經驗的醫師進行分析,并由兩位高年資影像科主任醫師在場進行指導,意見不一致時經協商達成一致意見。三位醫師對CRC患者的病理信息均不知情,定量指標均測量3次取平均值,主要分析/測量以下CT征象/參數。①臨床T(clinical T,cT)分期和臨床N(clinical N,cN)分期:根據第八版的AJCC標準進行評估;②病變部位:右半結腸包括近端 2/3的橫結腸、升結腸和盲腸;左半結腸或直腸包括遠端1/3橫結腸、降結腸、乙狀結腸和直腸[4];③病變腸管長度;④病變腸管最厚徑;⑤強化方式:強化均勻的標準為病灶在門靜脈期圖像上的最大與最小強化值的差值≤10 HU;反之則為不均勻強化[5];⑥測量病灶在各期圖像上的CT值并計算相對CT值(contrast ratio,CR):觀察平掃及三期增強圖像,選取腫瘤最大層面、腫瘤邊界最清晰的期相,在病灶內勾畫ROI,避開腫瘤邊緣約2 mm[6],并注意避開脂肪、氣體、腸內容物和鈣化等;并對同層面腹主動脈或其大分支進行ROI的勾畫,避開血管壁及斑塊。ROI通過復制粘貼方式保證各期圖像上ROI的大小和位置一致。測量各ROI的CT值并計算CR(病變CT值與同層面腹主動脈或其分支CT值的比值[7]),包括平掃(PCR)、動脈期(ACR)、靜脈期(VCR)和延遲期相對CT值(DCR)。

4.MSI狀態的檢測

在垂直于腸壁長軸的腫瘤最大層面,于病灶組織內取材。MSI是由4種DNA錯配修復蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)功能缺陷導致的,通過免疫組化方法觀察DNA錯配修復蛋白的缺失情況,在4種錯配修復蛋白中,一種或多種蛋白染色陰性即判定為MSI狀態,4種蛋白均為陽性則為MSS狀態[8]。

5.統計分析

使用SPSS 26.0及R4.3.0軟件進行統計分析。連續變量先采用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗,符合正態分布的數據以均數±標準差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態分布的數據以M(Q1,Q3)表示,兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。分類變量以例數(百分比)表示,兩組間比較采用χ2檢驗。將單因素分析結果顯示組間差異有統計學意義的指標納入多因素二元logistic回歸分析,得到與CRC患者MSI狀態相關的獨立危險因素。通過R軟件進行列線圖、ROC曲線、校準曲線及決策曲線(decision curve analysis,DCA)的繪制和分析,采用Hosmer-Lemeshow檢驗評價列線圖模型的擬合優度。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.患者臨床資料

共納入347例CRC患者,年齡28～90歲,中位年齡66歲;男200例,女147例。MSI組與MSS組及訓練集與驗證集之間臨床資料的比較結果見表1。

表1 MSI組與MSS組及訓練集與驗證集之間臨床資料的比較結果

MSI組的PLT及SII水平高于MSS組,差異有統計學意義(P<0.05);兩組之間其它臨床資料的差異均無統計學意義(P>0.05)。

訓練集和驗證集中MSI的出現率分別為20.58%(50/243)和20.19%(21/104),差異無統計學意義(χ2=0.044,P= 0.834)。兩組之間各項臨床資料的差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.CT征象分析

MSI組與MSS組及訓練集與驗證集之間CT征象/指標值的比較結果見表2。

表2 MSI組與MSS組及訓練集與驗證集之間CT征象的比較結果

相比于MSS組,MSI組中CRC更好發于右半結腸,強化更不均勻,且PCR、ACR、VCR及DCR值均較低,上述征象/指標在兩組間的差異均有統計學意義(P<0.05);其它CT征象,包括cT分期、cN分期、病變腸管長度及病變腸管最厚徑,在兩組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。

訓練集與驗證集之間各項CT征象/指標值的差異均無統計學意義(P>0.05)。

3.列線圖模型的建立

將組間差異有統計學意義的變量,包括PLT、SII、病變部位,強化方式、PCR、ACR、VCR及DCR,納入多因素二元logistic回歸分析,結果顯示PLT、SII、病變部位、強化方式和ACR是MSI的獨立危險因素(P均<0.05);PLT及SII每增加100×109/L,預后不良的風險分別增加1.458、1.051倍;PCR、ACR、VCR及DCR每增加0.1,預后不良的風險分別降低0.209、0.606、0.406和0.141倍,詳見表3。基于上述5個臨床和CT征象,構建列線圖(圖1)。

圖1 基于回歸分析篩選的臨床和CT特征構建的預測CRC患者MSI狀態的列線圖。 圖2 列線圖模型的ROC曲線,訓練集和驗證集中的AUC分別為0.765和0.783,表明該模型在預測CRC患者MSI狀態方面具有較高的效能。 圖3 列線圖模型的校準曲線,顯示模型預測MSI狀態的概率和實際概率之間具有良好的一致性。a)訓練集的校準曲線;b)驗證集的校準曲線。 圖4 列線圖模型的決策曲線,顯示在合理的風險閾值概率范圍內,列線圖模型在區分CRC患者MSI狀態方面具有較高的臨床凈效益。

表3 臨床-CT征象的多因素二元logistic回歸分析

4.列線圖模型效能的評估

繪制列線圖模型的ROC曲線(圖2),在訓練集和驗證集中AUC分別為0.765(95%CI:0.687～0.843)和0.783(95%CI:0.642～0.923),敏感度分別為0.760和0.762,特異度分別為0.684和0.819。校準曲線顯示列線圖模型在訓練集和驗證集中預測MSI狀態的概率與實際概率之間有著良好的一致性(圖3),Hosmer-Lemeshow檢驗結果顯示其差異均無統計學意義(P>0.05)。DCA結果顯示在合理的閾值概率范圍內,列線圖模型在區分CRC患者MSI和MSS狀態方面具有較高的臨床凈獲益率(圖4)。將本研究中構建的列線圖模型應用于建模人群之外的一例CRC患者,顯示本模型預測的MSI結果與病理結果相符合(圖5)。

圖5 女,80歲,結腸癌患者。a)增強CT動脈期橫軸面圖像,測量結腸壁腫瘤病灶的ACR約為0.20;b)增強CT靜脈期冠狀面圖像,顯示腫瘤病灶位于右半結腸,強化不均勻。此例患者術前1周內實驗室檢查結果顯示PLT為245.0×109/L、NE為9.0×109/L、LYM為0.8×109/L,計算得出SII為2756.3×109/L,參照列線圖模型,5項得分分別約為61.5、15.0、22.7、19.0和30.2,總得分為148.4,對應的MSI發生概率為71.2%;c)此例患者術后PMS2免疫組化染色圖像(×100),可見細胞核未見棕色染色,即染色陰性,提示為MSI狀態。

討 論

微衛星是指基因組中以少數幾個核苷酸(一般為1～6個)為單位串聯重復的DNA序列。正常組織中存在DNA錯配修復系統,最常見的DNA錯配修復基因是MLH1、MSH2、MSH6和PMS2,當任一DNA錯配修復基因發生突變,或出現MLH1啟動子高甲基化,可導致錯誤的微衛星序列累積,稱為MSI[9]。MSI檢測通常通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)、免疫組化和DNA測序等方法。PCR及DNA測序檢查技術因其花費大、耗時長,難以全面應用于臨床;免疫組化檢測花費小、耗時短且簡單易行,是我國臨床檢測微衛星狀態的基本推薦[10]。但上述方法均為有創檢測,且只能獲取病灶極小部分的樣本,難以反映全腫瘤的微衛星狀態。因此,臨床上需要一種簡單易行的術前預測CRC患者MSI狀態的方法。

本研究結果顯示,在納入的臨床指標中,PLT和SII與CRC患者MSI狀態密切相關。PLT除了止血方面的重要功能外,還是重要的炎癥指標,SII是近年來提出的一種基于NE、LYM和PLT的綜合性指標,能更好地反映機體的炎癥反應狀態[11]。已證實慢性炎癥與腫瘤的發生發展、復發轉移和免疫逃逸等關鍵環節密切相關,機體的炎癥與免疫水平可以通過炎癥指標來反映,且炎癥指標通常通過血常規及血生化檢查獲取,是臨床上對CRC患者常規進行且經濟、相對無創的檢測指標[12]。本研究中MSI組的PLT水平高于MSS組,這與既往的研究結果一致[13-14],且MSI組具有更高的SII,表明MSI狀態的CRC患者可能具有更強的炎癥反應,de Smedt等[15]的研究結果也支持本文觀點。

本研究結果顯示,在納入的CT征象中,病變部位、強化方式和ACR與CRC患者的MSI狀態密切相關。MSI更易發生于右半結腸,這與既往研究結果一致[16-17]。目前,增強CT強化特征用于評估CRC患者MSI狀態的研究較少。增強CT掃描是基于不同腫瘤新生血管的形成而產生不同的血流動力學改變,從而可對病灶進行定性分析[18];但是,病灶的CT值受多種因素的影響,如患者生理因素、操作者因素及設備因素等[19],為了降低這些因素對病灶定性分析的影響,本文運用了各期CR值即病變與同層腹主動脈或其分支的CT值比值,使CT值標準化,更為準確的評估CRC患者的MSI狀態,本研究結果顯示MSI組病灶的ACR低于MSS組,且病灶強化更不均勻,這可能與腫瘤內部黏液及壞死等成分相關,Greenson等[20]的研究結果亦佐證了本研究的結果。

列線圖能夠整合多種危險因素,實現對患者的個性化風險預測,已經廣泛用于多種腫瘤的預測[21-22]。但目前構建列線圖模型術前預測CRC患者MSI狀態的研究較少。本研究將篩選出的臨床和CT征象,包括PLT、SII、病變部位、強化方式及ACR共5個指標,用于構建列線圖模型,對模型的預測效能進行了多維度的分析,結果均顯示其具有較好的預測效能、預測準確性及臨床實用性,為術前預測CRC患者MSI狀態提供了一種簡單且直觀的指導工具。

本研究存在以下局限性:首先,本研究為單中心回顧性研究,雖然列線圖模型具有較好的預測效能,但仍需要多中心、大樣本和前瞻性的研究來進一步驗證。第二,本研究推測MSI組病灶的ACR低于MSS組且MSI組病灶強化更不均勻可能與腫瘤內部黏液及壞死等成分相關,但未能結合術后病理檢查進一步研究證實。第三,本研究分析的CT征象,如cT、cN分期、病變部位、病變腸管長度、病變腸管最厚徑、強化方式和各期CR值,在一定程度上受到放射科醫師的經驗和主觀因素的影響。

總之,PLT、SII、病變部位、強化方式和ACR是預測CRC患者MSI狀態的獨立危險因素,基于上述臨床和CT征象構建的列線圖模型具有良好的預測效能,這對今后的臨床工作有著十分重要的意義,可作為術前預測CRC患者MSI狀態的輔助工具,能夠協助臨床制訂CRC患者的治療策略和評估患者預后。