辣椒素納米膠囊通過(guò)抑制PI3K/Akt/GSK-3β途徑改善心肌纖維化的研究

梅毅，楊吉

浙江省人民醫(yī)院畢節(jié)醫(yī)院心胸血管外科，貴州畢節(jié) 551705

近年來(lái)，我國(guó)老齡化問(wèn)題及老齡人群面對(duì)的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題越發(fā)突出，心血管疾病作為危害老齡人生命安全的重要因素，進(jìn)一步探討其機(jī)制受到社會(huì)各界的關(guān)注。心肌梗死是臨床常見(jiàn)病，若不及時(shí)治療，隨著病情進(jìn)展，持續(xù)過(guò)度心肌重構(gòu)可引起充血性心衰，在心肌重構(gòu)中，心肌纖維化是一項(xiàng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，故探索一種可減輕心肌纖維化的方法或藥物對(duì)治療心肌梗死意義重大[1-3]。磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（Phosphatidylinositol Kinase 3-Kinase/Protein Kinase B/Glycogen Synthase Kinase 3β, PI3K/Akt/GSK-3β）通路在心臟保護(hù)、細(xì)胞代謝與增殖方面具有重要生理作用，大量研究表明，PI3K/Akt/GSK-3β通路在心血管疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。辣椒素具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等，在實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療中具有重要價(jià)值[4-5]。國(guó)內(nèi)關(guān)于辣椒素納米顆粒（Capsaicin/Nanoparticles, Cap/NPs）膠囊的報(bào)道甚少，關(guān)于Cap/NPs膠囊與心血管疾病方面研究幾乎空白。本文于2022年1月—2023年6月自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)40只雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討Cap/NPs膠囊對(duì)心肌梗死后心肌纖維的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：購(gòu)進(jìn)40只雄性健康SD大鼠，在適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，以隨機(jī)數(shù)表法分為4組，分別為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組，每組10只。各組大鼠體質(zhì)量230～250 g，各組體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過(guò)動(dòng)物倫理審批（倫審動(dòng)2024-1-1號(hào)）。

主要試劑與儀器：辣椒素為德斯特生公司提供，純度：98%；聚乳酸-輕基乙酸共聚物為Sigma公司提供，分子量7 000～17 000；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀，型號(hào)：TGL-16M；牛血清白蛋白產(chǎn)自阿拉丁公司，為96%生物技術(shù)級(jí)；Agilent高效液相色譜儀型號(hào)為1260Infinity Il；新芝超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)型號(hào)為SCIENTZ-IID；生物化學(xué)藥品P-c-Raf規(guī)格：100 μl；生物化學(xué)藥品P-GSK-3b規(guī)格：100 μl）；生物化學(xué)藥品P-akt473，生物化學(xué)藥品P-akt308，生物化學(xué)藥品P-PDK1；化學(xué)試劑助劑Masson三色染色試劑盒；化學(xué)試劑助劑×1型膠原ELisa Kit（96t）；高效RIPA裂解液。上海生工公司提供ELISA試劑盒，CAP/NPs膠囊由醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型構(gòu)建與分組 模型構(gòu)建：模型組與干預(yù)組大鼠予以95%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，心臟暴露后，對(duì)左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎，術(shù)后予以青霉素（國(guó)藥準(zhǔn)字H14022564；規(guī)格：250萬(wàn)U）40 000 U/d。假手術(shù)組采取相同操作，但不進(jìn)行結(jié)扎處理。對(duì)照組不予以任何干預(yù)，為正常大鼠。

分組：術(shù)后成功存活12 h大鼠分為模型組和干預(yù)組，干預(yù)組術(shù)后1 d給予大鼠Cap/NPs膠囊，35 mg/kg）1次/周；模型組術(shù)后1 d予以等量口服生理鹽水，持續(xù)4周。

1.2.2 標(biāo)本處理 術(shù)后4周處死大鼠，取心肌組織，做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

血清指標(biāo)：包括血清激活素A（Activin A, ACTA）、心房鈉尿肽（Atrial Natriuretic Peptide, ANP）、腦鈉肽（Brain Natriuretic Peptide, BNP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinases, MMP-9）、膠原纖維蛋白Ⅲ等。末次給藥24 h后采集大鼠血液標(biāo)本，標(biāo)本進(jìn)行離心處理后，使用ELISA法對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

PI3K/Akt/GSK-3β蛋白：各組大鼠心臟組織剪碎處理，分別加入適量的RIPA組織裂解液，提取標(biāo)本中的總蛋白，蛋白濃度使用BCA試劑盒測(cè)定，調(diào)整各組蛋白濃度，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行加熱變性處理，取樣品液20 μL進(jìn)行電泳處理，將分離蛋白用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，封閉處理2 h，在孵育盒中依照分子量置入目的蛋白條帶，分別加入兔源一抗[p-GSK-3β（1:250）、GSK-3β（1:250）、p-Akt（1:250）、Akt（1:250）、p--PI3K（1:300）、PI3K（1:300）]，4℃冰箱過(guò)夜，3次漂洗，按1∶1 000稀釋后加入羊抗兔二抗，溫室孵育2 h，再次漂洗3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，然后于標(biāo)本凝膠成像儀觀察條帶并拍照，組織中蛋白表達(dá)使用Image-J軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，血清指標(biāo)、PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)情況為符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以（）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，假手術(shù)組、模型組與干預(yù)組大鼠的ACT-A、ANP、BNP、MMP-9、膠原纖維蛋白Ⅲ水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；假手術(shù)組大鼠各指標(biāo)低于模型組與干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；模型組大鼠各指標(biāo)明顯高于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清指標(biāo)比較()

表1 各組大鼠血清指標(biāo)比較()

注：ACT-A：血清激活素A，ANP：心房鈉尿肽，BNP：腦鈉肽，MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，@P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

膠原纖維蛋白Ⅲ（ng/mL）26.13±1.30（28.63±1.54）*（67.62±1.85）*@（35.71±1.65）*@#組別對(duì)照組（n=10）假手術(shù)組（n=10）模型組（n=10）干預(yù)組（n=10）ACT-A（pg/mg）1.03±0.15（1.26±0.14）*（2.33±0.28）*@（1.60±0.17）*@#ANP（pg/mg）1.15±0.23（1.16±0.20）*（2.21±0.57）*@（1.45±0.38）*@#BNP（ng/L）62.05±7.40（70.44±9.95）*（212.04±17.36）*@（118.62±13.40）*@#MMP-9（ng/L）65.07±8.26（73.19±8.57）*（221.65±23.34）*@（126.08±14.56）*@#

2.2 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)比較

對(duì)照組大鼠的PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；假手術(shù)組PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)明顯高于模型組與干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；模型組PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)則明顯低于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)比較()

表2 各組大鼠心肌組織PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)比較()

注：p-GSK-3β：磷酸化葡萄糖合成激酶3β抗體，GSK-3β：糖原合成酶激酶3β，p-AKT：磷酸化蛋白激酶B，Akt：蛋白激酶B，p-PI3K：磷酸化磷酸肌醇3激酶，PI3K：磷酸肌醇3激酶；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，@P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

p-PI3K/PI3K 1.34±0.26（1.13±0.19）*（0.19±0.03）*@（0.69±0.14）*@#組別對(duì)照組（n=10）假手術(shù)組（n=10）模型組（n=10）干預(yù)組（n=10）p-GSK-3β/GSK-3β 1.32±0.27（1.10±0.18）*（0.23±0.05）*@（0.74±0.13）*@#p-AKT/AKT 1.33±0.24（1.11±0.15）*（0.24±0.04）*@（0.70±0.12）*@#

3 討論

心肌梗死作為一種常見(jiàn)心血管疾病，主要因心肌缺血、缺氧所致，可引起休克、心律失常，甚至造成心衰，對(duì)患者生命構(gòu)成威脅[6]。心肌梗死發(fā)生后局部重要組織會(huì)出現(xiàn)纖維化病變，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)附壁性血栓、內(nèi)膜組織增厚、肌漿空泡化、白色纖維條，隨著病情進(jìn)展，可引起心肌僵硬度增加、體積增大的癥狀，電生理結(jié)構(gòu)失常、舒張與收縮功能降低，最終誘發(fā)猝死[7-8]。故進(jìn)一步探索對(duì)預(yù)防心肌梗死組織纖維化病變的藥物，對(duì)改善患者預(yù)后的意義重大。

Cap/NPs是一種新型藥物，辣椒素受體TRPV1屬于非選擇性配體門(mén)控陽(yáng)離子通道，由6個(gè)跨膜蛋白構(gòu)成，分子量為95 kDa，由838個(gè)氨基酸組成，當(dāng)其與辣椒素結(jié)合后開(kāi)放通路，細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，改變內(nèi)外電荷平衡，發(fā)揮一系列生物效果，如抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)等[9-10]。推測(cè)Cap/NPs膠囊在治療心臟損傷方面具有一定積極作用。本研究結(jié)果顯示，模型組ACT-A（2.33±0.28）pg/mg、ANP（2.21±0.57）ng/L、BNP（212.04±17.36）ng/L、MMP-9（221.65±23.34）ng/L、膠原纖維蛋白Ⅲ（67.62±1.85）ng/mL明顯高于干預(yù)組（P均＜0.05），說(shuō)明Cap/NPs膠囊可一定程度減輕大鼠心肌損傷，預(yù)防心肌組織的纖維化發(fā)展。關(guān)于其具體機(jī)制目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

PI3K/Akt/GSK-3β通路在心肌細(xì)胞凋亡、組織損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中GSK-3β是PI3K/Akt通路的作用底物，屬于保守絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，PI3K/Akt通路被激活后，可進(jìn)一步強(qiáng)化GSK-3β磷酸化作用，抑制GSK-3β活性，降低細(xì)胞中線粒體的通透性，抑制細(xì)胞凋亡[11]。本研究顯示，對(duì)于干預(yù)組大鼠使用Cap/NPs膠囊治療后，模型組心肌組織PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)水平（0.19±0.03）%、（0.24±0.04）%、（0.23±0.05）%均明顯低于干預(yù)組（P均＜0.05），說(shuō)明Cap/NPs膠囊對(duì)心肌梗死大鼠心肌纖維化病變的改善可能通過(guò)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路起到作用，從而降低心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織纖維化程度，保護(hù)心肌組織。胡芮嘉等[12]研究中顯示，與研究干預(yù)組對(duì)比，模型組大鼠的PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)[（0.38±0.07）%、（0.37±0.06）%、（0.40±0.07）%]呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)（P均＜0.05），與本研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，大鼠心肌梗死模型建立后予以Cap/NPs膠囊干預(yù)，能夠有效抑制心肌纖維化發(fā)展，減輕大鼠心肌損傷，其機(jī)制可能與PI3K、Akt、GSK-3β蛋白活性調(diào)控及PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路傳導(dǎo)抑制有關(guān)。