應用生物信息學篩選結直腸癌Hub基因及驗證

陳樹華，溫日葵，祝惠欽，謝榮章

云浮市人民醫院檢驗科，廣東云浮 527300

結直腸癌為臨床中常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率在癌癥中排第3位，嚴重威脅人類健康。因此，早期識別結直腸癌診斷和預后相關生物標志物至關重要[1]。生物信息學為生物學、信息學相結合的內容，在闡述疾病分子機制方面起著積極的作用。基因芯片主要是通過微陣列技術將高密度DNA片段陣列依附著玻璃、尼龍等材料上，篩選出有價值的基因進一步研究分析，目前常用于收集疾病表達譜數據[2]。Hub基因是經生物信息學篩選出的核心基因，也是當前臨床疾病治療的潛在靶點[3]。云浮市人民醫院檢驗科運用生物信息學方法，篩選出結直腸癌相關的差異表達基因予以生物通路富集分析、制作蛋白-蛋白互作網絡，篩選出Hub基因，并于2017—2022年8月收集30例結直腸癌組織和30例正常結直腸組織樣本進一步驗證Hub基因表達，為今后臨床診治結直腸癌、評估預后轉歸提供新型的輔助工具。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象及芯片數據資料

收集2017—2022年8月本院就診的30例結直腸癌患者組織標本作為異常組，另收集30例非癌結腸組織作為正常組。從美國國立生物技術信息中心的基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus, GEO）中下載結直腸癌芯片數據GSE 21815、GSE 31905、GSE 35279資料，其中GSE 21815包括12例結直腸癌組織和9例正常結直腸對照組織；GSE 31905包括55例結直腸癌組織和7例正常結直腸組織；GSE 35279包括74例癌組織和5例正常組織。

1.2 方法

1.2.1 數據預處理 運用tidyverse軟件對獲取的芯片數據資料予以數據處理，對各樣本的基因文件進行命名，并把基因的表達量置于同一表達矩陣內。在metadata元數據庫中把樣本注釋內容提取出來，使其與表達矩陣相符。最后通過R語言的biomaRt包對標準基因符號進行標注，進而取得標準化的基因表達矩陣。

1.2.2 篩選差異基因 應用edgeR包、limma包將數據預處理獲得的基因表達矩陣進行差異表達基因分析，再應用GEO中的分析工具analyze with geo2r分為結直腸癌組織組和正常組織組，以∣logFC∣＞2，P＜0.01作為有效基因的納入標準[4]，篩選出GSE 21815、31905、35279數據集中的差異基因，并繪制韋恩圖，找出GSE 21815、31905、35279數據集中的共有基因。

1.2.3 提取lncRNA 在Gencode數據庫中收集和整理經過篩選的差異基因lncRNA相關信息，通過R軟件lncRNA內ensembl ID及其表達量等信息。

1.2.4 生物功能富集分析 運用生物信息學工具DAVID，將與正常結直腸組織有差異的結直腸癌相關差異表達基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）篩選出來，通過基因本體（Gene Ontology,GO）開展功能富集分析（包括細胞組分、分子功能、生物過程3個部分），并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。

1.2.5 蛋白互作網絡（Protein Protein Interaction,PPI）分析 在STRING數據庫上參與富集分析的DEGs基因進行PPI分析，應用Cytoscape構建PPI網絡。具體操作為：借助網絡分析算出網絡中心性參數—度中心性，用MCODE插件提取關鍵子網，獲得相對集中的表達子集，識別出結直腸癌的潛在調控基因。最后，用ClueGO、CluePedia把KEGG通路可視化，繪制生物通路之間的基因互作網絡，提取與通路之間相互作用程度排名前10的差異基因作為Hub基因。

1.2.6 結直腸癌組織樣本Hub基因表達驗證 應用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,qPCR）測量癌組織、正常結直腸組織中hub基因表達量沒具體方法。①提取總RNA：取0.3～0.5 g組織樣本，將其研磨成粉末狀，置于1.5 mL離心管內，根據RNA提取試劑盒說明書流程提取總RNA。②逆轉錄反應：根據逆轉錄試劑盒的操作流程進行逆轉錄反應，取200 ng RNA量，滴加1 μl特異性逆轉錄引物+12 μL無菌水，孵育5 min后，依次滴加Ribollock RNase抑制劑、RevertAid M-MuLV反轉錄酶。③RT-PCR反應檢測：以SYBR green法，設置反應體系：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，以U6作為內參基因，以2-△△Ct作為基因表達量，以正常結直腸組織為對照，得出結直腸癌組織中hub表達量。△△Ct=（Ct目的基因-CtU6）結直腸癌組織-（Ct目的基因-CtU6）正常結直腸組織。

1.3 統計方法

應用SPSS 26.0統計學軟件進行數據統計分析，計量資料（mRNA表達量）符合正態分布，以（）描述，行t檢驗，P＜O.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異基因篩選結果

GSE 21815（937）、31905（1470）、35279（1458）數據集共有141例結直腸癌組織和21例正常結直腸組織，3個數據集分別檢索到937個、1 470個、1 458個DEGs基因，在軟件上繪制韋恩圖后獲得共有上調基因105個、共有下調基因140個。

2.2 核心基因驗證

經PPI網絡圖分析可知，245個共有差異基因導入到STRING數據庫生成PPI網絡圖，并對PPI網絡圖進行可視化分析得出與PPI網絡相互作用程度最高的10個Hub基因，分別為催產素受體基因（Oxytocin Receptor, OXTR）、基質金屬蛋白酶11基因（Matrix Metalloproteinase-11, MMP11）、酪氨酸蛋白激酶受體B2基因（Erythropoietin-Producing Hepatoma-B2, EPHB2）、間質上皮轉化因子基因（Mesenchymal-Epithelial Transition Factor, MET）、轉化生長因子β1基因（transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）、抑制斯鈣素-2基因（Stanniocalcin-2, STC2）、基質金屬蛋白酶7基因（Matrix Metalloproteinase-7, MMP7）、激肽釋放酶8基因（Kallikrein-8, KLK8）、激肽釋放酶10基因（Kallikrein-10, KLK10）、角蛋白23基因（Keratin-23, KRT23）。結直腸癌組織的MMP11、c-MET、MMP7、KLK8、KLK10 mRNA表達量明細高于正常結直腸組織，差異有統計學意義（P均＜0.05）。而結直腸癌組織與正常結直腸組織的OXTR、EPHB2、TGF-β1、STC2、KRT23 mRNA表達比較，差異無統計學意義（P均＞0.05），見表1。

表1 結直腸癌組織與正常結直腸組織10個Hub基因mRNA表達量比較()

表1 結直腸癌組織與正常結直腸組織10個Hub基因mRNA表達量比較()

注：OXTR：催產素受體基因，MMP11：基質金屬蛋白酶11基因，EPHB2：酪氨酸蛋白激酶受體B2基因，MET：間質上皮轉化因子基因，TGF-β1：轉化生長因子β1基因，STC2；抑制斯鈣素-2基因，MMP7：基質金屬蛋白酶7基因，KLK8：激肽釋放酶8基因，KLK10:激肽釋放酶10基因，KRT23：角蛋白23基因。

KRT23 0.96±0.15 0.98±0.15 0.545 0.588組別結直腸癌組織（n=30）正常結直腸組織（n=30）t值P值OXTR 0.87±0.09 0.79±0.12 1.661 0.102 MMP11 4.38±1.58 1.57±0.27 9.605＜0.001 EPHB2 2.99±0.51 2.85±0.38 1.213 0.230 MET 2.69±0.29 1.01±0.21 25.339＜0.001 TGF-β1 1.40±0.31 1.24±0.36 1.856 0.068 STC2 1.43±0.23 1.37±0.21 1.024 0.310 MMP7 0.88±0.14 0.17±0.04 26.376＜0.001 KLK8 11.09±3.90 4.00±1.18 9.541＜0.001 KLK10 7.88±2.20 5.96±1.76 3.726＜0.001

3 討論

目前已有大量基礎研究、臨床研究揭示了結直腸癌發生發展的病因病機[5-6]，但其患病率、病死率近年仍居高不下，有學者認為其原因主要是大多數研究是針對單個遺傳學事件進行隊列研究，造成結果偏倚[7]。本研究選擇GSE 21815、GSE 31905、GSE 352793個數據庫運用生物信息學深入研究，篩選獲得245個結直腸癌相關差異表達基因，而且對上調、下調245個共有差異基因進行GO生物功能分析結果顯示，①上調DEGs基因的細胞組分（Cellular Component, CC）涉及細胞外基質、細胞外區域、細胞質膜等；下調基因細胞組分涉及細胞外區域、細胞外謎題、細胞間膜蛋白等。②上調基因的分子功能主要是序列特異性DNA結合蛋白活性、RNA聚合酶Ⅱ、生長因子激活等；下調基因分子功能主要為激素激活體系、結合鋅離子的蛋白質。③上調基因的生物過程（Biological Process, BP）包括細胞增殖、細胞凋亡、藥物反應、蛋白質水解等；下調基因生物過程包括蛋白質水解、小分子物質跨膜轉運等。經KEGG富集分析可知，上調DEGs基因主要富集分布轉化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β)信號通路、Wnt信號通路；下調DEGs基因富集于PPAR信號通路、氮代謝信號通路等。由此可見，上調基因主要分布在細胞核、細胞膜、細胞外，通過調節DNA復制、參與細胞周期等過程以參與結直腸癌細胞的細胞遷移、增殖和凋亡。而下調基因主要分布在細胞外區域，參與機體代謝，進而對癌癥發生發展起作用。

本研究制作差異基因蛋白互作PPI網絡獲得10個Hub基因，并經臨床組織樣本驗證發現，結直腸癌組織中基質金屬蛋白酶11基因（4.38±1.58）、間質上皮轉化因子基因（2.69±0.29）、基質金屬蛋白酶7基因（0.878±0.143）、激肽釋放酶8基因（11.09±3.90）、激肽釋放酶10基因mRNA（7.88±2.20）mRNA表達顯著高于正常結直腸組織組織（P均＜0.05）。基質金屬蛋白酶（MMPs）對細胞外基質、基底膜蛋白酶有溶解作用，在正常情況下該物質在體內的表達水平較低，但若發生病理改變，特別是出現癌細胞增殖分化、遷移等，其表達水平會顯著升高[8]。MMP11就是MMPs中的一員，可通過重構細胞外基質誘導腫瘤進展，并可通過抑制細胞凋亡使腫瘤細胞存活[9]。MMP7是MMPs中分子量最少的分泌蛋白，其能夠溶解細胞外基質，并可水解機體蛋白多糖、膠原底物，促進腫瘤細胞增殖分化[10]。目前已有研究報道，MMP11（4.25±1.19）、MMP7（0.886±0.125）在多種癌組織中呈高表達[11]。李軍彥等[12]的研究顯示，MMP7表達能夠提示結直腸癌病情發生及其進展。溫凌等[13]研究也發現，檢測MMP-11能夠輔助診斷結直腸癌發生發展情況。C-Met為原癌基因的一種，能夠使活化信號傳導通路發生磷酸化，促使細胞運動，進而引起上皮細胞分散、內皮細胞遷移，腫瘤細胞發生浸潤遷移。另有研究報道，C-Met能夠誘導腫瘤血管新生[14]。曹明等[15]研究證實，結直腸癌患者癌組織CMet表達水平與癌細胞侵襲轉移呈正相關，對于判斷預后有一定指導意義。已有研究證實，KLKs與惡性腫瘤發生發展密切相關，其作用機理是通過編碼hK蛋白溶解腫瘤細胞外基質蛋白，促使癌細胞遷移和腫瘤血管新生[16]。相關文獻報道，KLK8能夠促進結直腸癌細胞增殖、轉移，其過表達能夠抑制腫瘤細胞凋亡，敲低KLK8后會促使癌細胞凋亡[17]。另有研究發現，KLK10在結直腸癌組織中異常表達，與腫瘤病理分期、肝轉移發生呈正相關[18]。由此可見，MMP11、c-MET、MMP7、KLK8、KLK10高表達，能夠促進結直腸癌細胞增殖分化、浸潤遷移、

綜上所述，本文利用生物學信息方法進行篩選和驗證了一組與結直腸癌發生發展密切相關的基因，有望成為作為早期預測結直腸癌的標志物，為后續結直腸癌基礎研究及臨床診療提供依據。