基于生物信息學分析多囊卵巢綜合征中影響卵巢生長發育的關鍵差異基因

沈蓓蕾,李 娜,李聚學,劉 煜*

(南京醫科大學 1.附屬逸夫醫院 內分泌科;2.生物化學與分子生物學系,江蘇 南京211166)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是女性最常見的內分泌紊亂疾病之一,約占育齡期女性的5%～10%[1]。PCOS患者表現出生殖異常和內分泌代謝異常。生殖異常包括高雄激素血癥、排卵障礙和生育能力下降等。代謝異常包括肥胖、胰島素抵抗、肝脂肪變性和血脂異常等,且這些代謝異常增加罹患2型糖尿病和心血管疾病的風險[2]。近年來,隨著分子、結構和化學生物學方法的進步,如高通量測序技術、表觀基因組分析、微陣列基因表達分析、代謝組學、基因轉錄調控、蛋白組學等方法在疾病病因分析、診斷和治療中的應用也越來越廣泛[3-5]。有研究者應用RNA測序和全基因組DNA甲基化分析方法對PCOS小鼠子代的卵巢組織進行檢測,發現DNA為低甲基化水平,同時還獲得了一些與胰島素分泌調節、脂質代謝和炎癥反應相關的關鍵基因,如胰島素降解酶(insulin degrading enzyme,Ide)、鞘磷脂合酶 2(sphingomyelin synthase 2,Sgms2)、前列腺素-內過氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)等,為PCOS的遺傳學研究及診斷提供新思路[6]。此外,應用代謝組學技術檢測PCOS患者的血液、尿液及卵泡液樣本發現PCOS患者體內與脂質、氨基酸以及檸檬酸循環等能量代謝有關的代謝物處于紊亂狀態[7]。而最新的一項蛋白組學研究也顯示,參與炎癥、免疫和代謝生物學過程的一些蛋白質在PCOS患者卵泡液中上調[8]。這些組學結果都為PCOS的研究提供了新的靶點。然而,PCOS的病因非常復雜,其發病機制仍在進一步探索中[9]。因此,應用生物信息學技術以期快速有效地篩選PCOS關鍵候選基因,有可能為后期的機制研究提供新的方向。

GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫是一個國際公共存儲庫[10],用于存儲微陣列、二代測序和其他形式的高通量功能基因組數據,該數據庫由國家生物技術信息中心 (National Center of Biotechnology Information,NCBI) 建立和維護[11]。近年來,測序技術的高速發展,已經在臨床疾病領域取得了重大進展,運用范圍從臨床分子診斷到分子分類,從患者分層到預后預測,以及發現新的藥物靶點來進行應答預測[12]。

比較毒理基因組學數據庫(CTD)是一個公開可用的數據庫,整合大量化學物質、基因、功能表型和疾病之間相互作用,為研究疾病的潛在機制提供了便利[13]。

本研究采用生物信息學方法從GEO數據庫中搜索有關多囊卵巢綜合征的基因表達譜,選取兩個數據集的差異基因交集并驗證了與卵巢功能相關的關鍵基因,相比單個數據集結果更可靠,為探索PCOS的發病機制提供新的靶點。

1 資料和方法

1.1 資料和材料

從NCBI的GEO數據庫檢索與PCOS及卵巢相關的數據集,選取了兩個數據集(GSE171431和GSE59456),其中GSE171431來自Affymetrix的GPL20258,GSE59456來自Affymetrix的GPL1355(表1)。脫氫表雄酮(DHEA)(美國Sigma-Aldrich公司);芝麻油(國藥集團化學試有限公司);睪酮(testosterone,T)、促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);RNA提取試劑Trizol(TaKaRa)、逆轉錄和PCR試劑盒(南京諾唯贊公司);蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色試劑盒(南京凱基生物公司);瑞士-吉姆薩染色試劑盒(Biosharp生物有限公司)。

表1 數據集基本信息

1.2 方法

1.2.1篩選差異基因 使用R語言limma包對上述兩個數據集進行分析,以P<0.05且|log2FC|>1為閾值鑒定PCOS組和對照組卵巢組織中的差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)。

1.2.2差異基因的韋恩圖繪制 用ggvenn包對兩個基因表達譜的差異基因取交集從而得到共同差異基因。

1.2.3差異基因的聚類熱圖和火山圖繪制 本研究使用ggplot2包和pheatmap包繪制差異基因的表達熱圖,為了直觀展示PCOS組和對照組卵巢之間差異基因的表達情況,用ggplot2包和ggrepel包繪制火山圖。

1.2.4差異基因的GO和KEGG富集分析 GO數據庫把基因的功能分成了三個部分,分別是細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和生物過程(biological process,BP)。KEGG數據庫擁有多個子數據庫,包含基因組,生化反應,生化物質,疾病與藥物,以及最常用的通路信息。利用clusterProfiler包和org.Mm.eg.db包對共有差異基因進行GO注釋富集分析和KEGG通路富集分析,然后采用ggplot2繪制富集圖。

1.2.5實驗動物分組和PCOS模型的建立 從南京醫科大學實驗動物中心購入9只SPF級3周齡的健康雌性C57BL/6小鼠,動物實驗過程由南京醫科大學動物實驗中心和倫理委員會批準。所有小鼠置于SPF級環境中飼養,光照/黑暗12 h交替,自由飲水和飲食。將小鼠隨機分為兩組,分別為對照組4只和PCOS組5只。對照組:95%乙醇和芝麻油,連續皮下注射21 d;PCOS組:DHEA粉末溶于95%乙醇和芝麻油,按照小鼠每100 g體重6 mg DHEA進行給藥,連續皮下注射21 d。

1.2.6PCOS組小鼠的納入標準 連續皮下注射DHEA后若小鼠出現發情周期紊亂,卵巢組織形態學顯示卵巢多囊化改變,血清雄激素水平升高則認為PCOS小鼠模型構建成功。這與臨床的鹿特丹診斷標準相似。

1.2.7動情周期的監測 從皮下注射第13天開始,每天使用移液槍吸取20 μl PBS沖洗小鼠陰道收集陰道上皮細胞,持續10 d。將小鼠陰道內液體滴在載玻片上并推開,涂片自然干燥后用甲醇固定3 min,最后用瑞士-吉姆薩染色試劑盒進行染色。在光學顯微鏡下根據陰道細胞(包含核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞)占比及形態判斷小鼠的動情周期階段。

1.2.8卵巢組織HE染色 小鼠卵巢組織用4%多聚甲醛固定,然后進行石蠟包埋、切片、HE染色及封片,最后在鏡下觀察卵巢形態并統計卵泡和黃體數目。

1.2.9血清性激素水平檢測 使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清T、LH和E2水平,根據試劑盒說明書操作,最后用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的光密度值。根據標準曲線計算樣品的激素水平。

1.2.10實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction RT-qPCR)檢測差異基因mRNA水平 小鼠卵巢組織提取RNA后進行逆轉錄,用SYBR Green Realtime PCR試劑盒檢測差異基因 mRNA水平,最后使用2-ΔΔCt法計算檢測基因mRNA的相對表達水平,相關引物序列見表2。

表2 引物序列

1.2.11CTD分析 將基因名稱輸入CTD,找到與基因最相關的疾病,并利用Excel繪制雷達圖。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 差異基因的篩選

在GEO數據庫選取了兩個數據集,分別為GSE171431和GSE59456。根據P<0.05且|log2FC|>1為差異表達閾值,從數據集GSE17143篩選出151個DEG,其中101個為下調基因,56個為上調基因;從數據集GSE59456篩選出721個DEG,其中385個為下調基因,336個為上調基因,對兩個數據集的DEG進行熱圖繪制和火山圖分析(圖1A～D)。之后對兩個數據集的DEG取交集并繪制韋恩圖(圖1E),最后獲得24個下調基因和3個上調基因(表3)。

A～B.差異基因熱圖(紅色代表上調;藍色代表下調);C～D.差異基因火山圖(紅色表示上調基因;藍色表示下調基因;灰色表示無差異基因);E.兩個數據集共同差異基因韋恩圖

表3 共同差異基因

2.2 差異基因的功能和通路富集分析

使用R語言對共有的27個DEG進行GO和KEGG富集分析,GO功能富集分析的二級條目包含BP、CC和MF。BP富集分析表明大量DEG參與類固醇代謝過程、類固醇生物合成過程和膽固醇代謝過程;CC富集分析提示DEG主要涉及過氧物酶體、線粒體嵴和細胞器外膜;對于MF分析,DEG主要集中在氧化還原酶活性、單氧酶活動和酰胺結合(圖2A)。此外,KEGG聚類分析結果顯示差異基因富集在類固醇生物合成、卵巢類固醇生成、皮質醇的合成和分泌、PPAR信號通路、膽固醇和脂肪酸代謝、催乳素信號通路和過氧物酶體(圖2B)。

A.GO富集分析圖;B.KEGG富集分析圖

2.3 PCOS小鼠模型的建立

皮下連續注射DHEA構建PCOS小鼠模型,采用陰道涂片監測兩組小鼠動情周期,結果表明DHEA注射組小鼠的動情周期發生明顯紊亂,基本停滯在發情期和發情后期(圖3A～B)。卵巢HE結果顯示,與對照組相比,DHEA注射組小鼠卵巢組織中病理性囊狀卵泡數目增加,顆粒層減少,黃體數目減少,說明DHEA注射組小鼠卵巢組織發生排卵障礙(圖3C)。此外,用ELISA檢測了兩組小鼠血清性激素水平,發現DHEA注射組小鼠血清T、LH和E2水平明顯升高(P<0.05,圖3D～F)。根據對上述結果的分析,本研究DHEA注射組小鼠具備了PCOS小鼠特征,PCOS小鼠模型構建成功率為80%。

A.兩組小鼠陰道涂片(瑞士-吉姆薩染色,×100);B.兩組小鼠動情周期(P:動情前期;E:動情期;M:動情后期;D:動情間期);C.兩組小鼠卵巢組織形態學及黃體和囊狀卵泡統計(HE,×100);(“*”表示黃體,“#”表示囊狀卵泡);D～F.兩組小鼠血清性激素水平[T(D)、LH(E)、E2(F)]

2.4 差異基因的驗證

依據差異倍數和卵巢功能相關(例如排卵、細胞凋亡、卵泡生長和黃體形成等)篩選出4個差異基因進行驗證。與對照組相比,PCOS組小鼠卵巢組織中Sfrp4、Sema3d、Fkbp5和Prss3 mRNA表達明顯下調(P<0.05,圖4A～D)。

A.兩組小鼠卵巢Sfrp4 mRNA水平;B.兩組小鼠卵巢Sema3d mRNA水平;C.兩組小鼠卵巢Fkbp5 mRNA水平;D.兩組小鼠卵巢Prss35 mRNA水平

2.5 CTD分析

運用CTD數據庫查找與關鍵基因相關的疾病,發現這4個差異基因與卵巢疾病、性發育障礙、青春期性早熟和青春期延遲有關(圖5A-D)。

A～D.與基因Sfrp4、Sema3d、Fkbp5及Prss35相關的疾病

3 討論

排卵功能障礙通常由內分泌紊亂引起,是育齡婦女生育能力低下的常見原因,其中PCOS是最常見的原因[14]。可以通過適當的藥物和生活方式來干預PCOS的發展,但目前其病因未充分明確,治療的選擇仍然有限[15]。因此,探索PCOS的發病機制并找到合適的治療靶點具有重要的意義。

隨著高通量測序的快速發展,基因表達譜的生物信息學分析已廣泛應用于研究分子機制和識別潛在治療靶點[16]。在本次研究中,選取了兩個數據集并對兩個數據集的差異基因取交集,最終獲得27個差異基因。之前有研究者用生物信息學分析了我國PCOS患者的顆粒細胞全轉錄組圖譜,篩選出的基因主要與膽固醇和甾醇分解代謝、氧化還原酶活性和細胞脂質生物合成相關,發現Idh1、Dhcr7、Scrab1下調[17]。此外,還有研究運用人卵巢基因芯片鑒定出PCOS患者卵巢的差異基因[18],但是其篩選出的差異基因與本研究的結果不一致,導致這些結果的原因可能是物種、實驗和分析方式不同。本研究在進行蛋白互作網絡分析及核心基因計算分析時發現篩選的基因大多富集在膽固醇和性腺類固醇生物合成通路上,且相關基因公認與PCOS發病機制相關,從中選取了除此之外的差異倍數較大且與卵巢功能相關的基因進行實驗驗證,其驗證結果與數據集結論一致并以此來確定與PCOS相關的潛在關鍵基因分別為Sfrp4、Sema3d、Fkbp5、Prss35。

Sfrp4作為Sfrp家族中分子量最大的糖蛋白,是Wnt配體的拮抗劑,抑制典型 Wnt 信號通路,而雄激素與受體結合激活Wnt 信號通路。Sfrp4還參與細胞增殖和分化,具有凋亡和抗血管生成特性,因此被確定為多種癌癥(如乳腺癌、前列腺癌、膠質瘤和卵巢癌)中的腫瘤抑制因子[19-20]。哺乳動物在卵泡發育過程中會選擇優勢卵泡進行排卵,其余卵泡則經歷生理性閉鎖的退行性過程,而顆粒細胞凋亡在這一過程中發揮重要的作用。有研究表明Sfrp4定位于成熟卵泡的顆粒層,促進黃體細胞凋亡,而在PCOS患者卵丘細胞和顆粒細胞中Sfrp4表達下調,因此,PCOS組雄激素水平升高和Sfrp4下調可能影響這些細胞正常凋亡導致排卵異常[21-24]。

Sema3d也稱為coll-2或Sema-Z2,位于染色體7q21.11上,有17個外顯子和16個內含子,近期研究表明其介導多種腫瘤的發生和發展[25]。有研究表明高水平Sema3d能夠抑制與細胞生長、分化和凋亡有關的MAPK/ERK信號通路,當該通路在PCOS患者顆粒細胞中被激活時,PCOS患者的卵巢組織則產生大量的生長卵泡從而使成熟卵泡缺乏[25-26]。而雄激素受體信號通路中的非基因組信號轉導主要發生在細胞質,其激活后與 PI3K/Akt、Src、Ras 和 PKC 等多種信號分子相互作用,并激活 MAPK/ERK等通路引起細胞增殖[27]。因此,PCOS組卵巢Sema3d減少可能通過激活雄激素受體信號轉導中的MAPK/ERK通路而導致PCOS的發生。

抑郁和焦慮在PCOS患者中是常見的精神健康問題,而Fkbp5編碼的FK-506結合蛋白5是應激反應的重要調節因子,其在很多內分泌代謝疾病中發揮重要作用。Fkbp5能夠通過調節AKT2信號傳導維持葡萄糖穩態。此外,在應激條件下,綿羊卵巢組織中黃體生成素/促卵泡激素信號相關基因Fkbp5表達下調從而影響卵巢發育。另有研究表明PCOS患者的Fkbp5 DNA甲基化減少且伴有腸道菌群失調,以上研究表明Fkbp5可能參與PCOS的發生發展[28-30]。

Prss35屬于絲氨酸蛋白酶的胰蛋白酶類,這種蛋白酶在卵巢中高表達,表明Prss35參與卵巢功能。有研究表明人卵母細胞中Prss35 mRNA水平與其受精潛力有關[31]。Prss35還在排卵過程中受到動態調節,它在排卵前卵泡的顆粒細胞中被高度誘導表達,表明它在排卵期間卵泡壁的破壞中起作用;其在黃體消退期間也表達,但在功能性黃體中不表達,表明主要參與組織重塑和降解[32]。這些說明Prss35表達下調可能導致排卵障礙引起PCOS。但是目前還缺乏文獻具體報道Prss35涉及PCOS的致病環節及通路。

綜上所述,本研究基于GEO數據庫分析得到PCOS動物模型卵巢組織的差異基因,并用PCOS小鼠模型驗證了與卵巢功能相關的4個基因,這些基因在卵泡生長、排卵和代謝途徑中發揮一定作用,CTD分析顯示這些基因跟卵巢生殖疾病密切相關,可能有利于發現新的PCOS發病的分子機制。本文章也存在一些不足,首先,研究是基于GEO數據庫,其來源以及分析可能存在一定偏倚。其次,篩選出的基因未在PCOS患者和健康志愿者血清中以及其他PCOS動物模型中進行驗證。因此,還需要深入的研究進一步探索差異基因在PCOS中發揮作用的具體機制。