七氟醚對小鼠海馬區BDNF-TrkB-CREB 信號通路表達影響及其氧化應激機制研究

蘇鳳龍,劉 軍,郭艷苓,楊 穎,韓玉琴

(河北省承德市婦幼保健院 1.麻醉科;2.院辦;3.產科,河北 承德067000)

七氟醚是目前廣泛應用于手術麻醉的一類全麻輔助用藥,和咪達唑侖相比,七氟醚可減輕手術過程中的應激反應、術后躁動和術后疼痛,提高圍手術期病人的舒適度。新生兒和嬰幼兒因疾病不可避免地需要接受外科手術、有創性治療或影像學檢查,從而需要接受各種麻醉藥和鎮靜藥的輔助治療,因此,麻醉藥對發育中大腦的影響越來越受到關注。妊娠末期以及出生后早期是大腦學習記憶功能發育的關鍵時期,神經系統對內外環境的變化異常敏感,海馬CA3區被認為與空間辨別性學習記憶活動的關系最為密切[1-3]。腦源性神經營養因子(BDNF)/酪氨酸蛋白激酶B(TrkB)/環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)信號通路在中樞神經系統發育過程中,對神經元的存活、分化、生長、發育均起到重要的導向作用。BDNF-TrkB-CREB 信號通路還能有效防止神經元受損傷死亡、改善病理狀態下的神經元、促進受損傷神經元再生及分化等生物修復效應,而且也是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能所必需[4-8]。本研究從動物實驗角度,分析七氟醚對小鼠海馬區BDNF-TrkB-CREB 信號通路表達影響,并探討其氧化應激機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只6～7周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠,體質量15～20 g。購于河北醫科大學生物醫學工程中心,生產許可證號:SCXK(冀)2019-001。小鼠于籠中適應性飼養7 d。HAV-1病毒株(MacIntyre)來源:美國ATCC公司,通過Vero細胞培養48 h,當有50%VERO細胞變大或變圓,收集病毒測定病毒滴度,半數組織培養感染劑量為10-5,選擇10-4濃度接種小鼠。

1.2 藥品、主要試劑和儀器

七氟醚(四川省維克奇生物科技有限公司);谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)ELISA試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司);兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗鼠核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG(北京百奧萊博科技有限公司);RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司);青-鏈霉素混合液(華北制藥股份有限公司)。SIM BFI-HR型激光散斑血流成像系統(PRO微光電科技有限公司);211型二氧化碳培養箱(美國ThermoScience公司);K30B型電熱干燥滅菌器(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.3 模型建立與分組

遵循隨機化原則及等額原則分為對照組/實驗組,每組16只。對照組:生理鹽水腹腔注射,連續注射5 d。采用頸椎脫臼法將小鼠處死。實驗組:行七氟醚吸入誘導,七氟醚揮發罐開至8%,氧流量6 L/min,監測七氟醚的呼出濃度(Exhalation concentration of sevoflurane:ETsevo)。觀察小鼠呼吸運動,必要時給予輔助呼吸。當ETsevo達3%,且小鼠意識消失、下頜松弛時,維持 ETsevo在3%。待小鼠麻醉成功后采用頸椎脫臼法將小鼠處死。

小鼠海馬組織處理方法:(1)將小鼠顱骨沿顱中縫撬開,暴露顱內后使用眼科鑷取出海馬組織,于3.5%多聚甲醛中固定4 h,然后用75%、90%、100%三個濃度梯度的乙醇進行脫水,包埋切片,留待備用;(2)冷凍臺分離小鼠海馬組織,移入-80℃冰箱凍存備用;(3)冰凍切片取出后,二甲苯、酒精脫蠟,蒸餾水浸潤5 min,PBS沖洗3次,沖洗結束后滴加由PBS配制成的4%羊血清封閉液,室溫下封閉30 min后添加一抗(BDNF/TrKb/CREB抗體的稀釋濃度均為1∶1 000),冰箱凍存過夜,次日取出去除一抗,再用 PBS 清洗后滴加熒光素標志稀釋的二抗(BDNF/TrKb/CREB抗體的稀釋濃度均為1∶4 000),避光條件下孵育4 h。(4)用封片劑進行封片,吸盡多余液體,于4℃黑暗環境下晾干保存,熒光顯微鏡觀察并拍片。

1.4 氧化應激因子水平檢測

取出海馬組織勻漿樣品和ELISA試劑盒,按照MDA、GSH-Px和SOD試劑盒說明書操作,于標準管、空白管、測定管分別加入10 nmol·mL-1標準品、無水乙醇和測試樣品50 μL,充分混勻37℃水浴30 min,棄液拍干,各孔內加入抗體工作液100 μL,37℃水浴30 min,洗板拍干,加入顯色劑A液與B液50 μL暗處反應20 min,加入終止反應。酶標儀蒸餾水調零,1 cm光徑,于532 nm處測定吸光值,繪制標準曲線,計算待測樣品濃度。

1.5 海馬組織HE染色觀察

取固定后的小鼠海馬組織,依次放入梯度酒精溶液逐步脫去組織水分,再使用二甲苯處理至組織透明。將組織浸入石蠟杯,待石蠟冷卻凝固后,切片機切成5 μm的薄片,再于熱水中進行展平,撈取組織切片室溫下干燥,在60℃烤箱中烘烤1 h。切片脫蠟脫水后用蘇木精染液浸染5 min,流水沖洗再于鹽酸酒精中分化10 s,流水沖洗,伊紅染液浸染2 min,流水沖洗,再次使用不同濃度酒精脫去組織水分,二甲苯處理至透明,最后使用中性樹脂封片,置于光學顯微鏡下觀察海馬組織病理學變化。

1.6 RT-PCR檢測BDNF/TrKb/CREB mRNA表達

取出小鼠海馬組織剪取約100 mg放入1.5 mL無酶EP管內,加入1 mLRNAiso Plus,劇烈震蕩充分勻漿,使用Trizol法提取總RNA。取1 μL RNA樣品使用核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和純度。通過RNA濃度計算所需上樣體積,按照PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒獲得cDNA。使用兩步法進行PCR擴增反應,引物序列設計為:BDNF上游5′-TCTTGGAGTAAGTCGAGA-AGTGT-3′,下游5′-GTTGAAACTGAGCGAAAA-AGGC-3′;TrKb上游5′-CTTTAGTCAGCGACAGAAGGAC-3′,下游5′-AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG-3′;CREB上游5′-TAGATGACCATGAGTCGCTTGC-3′,下游5′-GCCAAACTTGCTCCATGTCCGG-3′。PCR反應體系為SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 6 μL。于95℃ 5 s,60℃ 10 s,72℃ 15 s共進行40個循環。反應結束后繪制熔解曲線,使用2-△△CT法計算基因表達的相對定量結果。

1.7 Western Blot檢測BDNF/TrKb/CREB蛋白表達

取小鼠海馬組織放入勻漿器內,按照1∶10比例加入RIPA組織裂解液,冰水浴中充分研磨至組織完全裂解。4℃下,12 000 r·min-1離心15 min,吸取上層清液。取少量上層清液按照BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度,計算蛋白上樣量。上樣后加入分離膠與濃縮膠開始電泳,在80 V下電泳至Marker分離出紅色標記,轉為120 V電泳至分離膠底部。電泳結束后,電流210 mA下轉至PVDF膜。加入脫脂奶粉孵育1 h后,放入10 mL目標蛋白對應的稀釋一抗工作液(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST清洗PVDF膜,加入稀釋二抗工作液(1∶3 000)孵育2 h。TBST清洗PVDF膜5次,滴加ECL發光液,設置參數曝光顯影,保存蛋白條帶并分析目的條帶光密度值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 2組實時免疫熒光定量PCR結果

與對照組比較,實驗組小鼠海馬組織中 BDNF mRNA、Trkb mRNA、CREB mRNA 基因表達量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 2組實時免疫熒光定量 PCR 結果比較

2.2 2組蛋白免疫印跡分析結果

實驗組BDNF、Trkb、CREB蛋白表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。各組小鼠海馬 BDNF、Trkb、CREB 蛋白表達水平見圖1。

圖1 兩組蛋白免疫印跡分析結果

表2 2組蛋白免疫印跡分析結果比較

2.3 2組小鼠氧化應激因子水平比較

與對照組比,實驗組小鼠海馬組織中MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 2組小鼠氧化應激因子水平比較

2.4 2組海馬組織HE染色比較

結果顯示,實驗組小鼠海馬組織結構完整,神經細胞排列整齊有序,血管豐富,未見炎性細胞浸潤、水腫等現象。對照組小鼠海馬組織結構破壞嚴重,可見大量變性和壞死的神經細胞,且有大量炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 海馬組織HE染色結果(A實驗組;B對照組,×200)

3 討論

人類神經系統發育的高峰期是妊娠后期三個月至出生后第一年,而小鼠則發生在出生后兩周內,出生7 d的小鼠相當于36周的胎兒,故本實驗選用新生7 d的SD小鼠作為研究對象。細胞凋亡是機體為了維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的程序性死亡,涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用。有研究大鼠大腦暴露七氟醚后引起顯著的神經元凋亡,其中新皮層區域受損最嚴重,同時也引起了少突膠質細胞的凋亡,因為這個階段的少突膠質細胞的軸突正處于髓鞘化階段[9]。

小鼠吸入七氟醚后,機體通過一系列神經細胞表達的Toll受體來識別病原體啟動免疫系統應答反應,產生大量炎性因子與活性氧化物,過度的免疫炎癥反應會導致中樞神經系統感染過程中引發海馬組織損傷,減少腦血流量[10]。如不能及時阻止過度炎癥反應所導致的組織細胞破壞,可引發海馬組織不可逆性損傷,甚至持續性惡化[11]。

在本研究中,模型組小鼠海馬組織中BDNF/TrKb/CREB基因與蛋白表達水平均呈下降趨勢,結合小鼠MDA、GSH-Px、SOD水平和腦血流指數的變化,提示模型組小鼠體內BDNF/TrKb/CREB通路受到抑制,氧化應激水平升高,腦血流指數降低。海馬組織受到損傷,皮層的血流與供氧均會發生變化,正常生理條件下,為了維持離子水平與神經功能,大腦對能量的需求增加,為了維持代謝平衡,皮層神經元等細胞會釋放各類神經遞質調節血流變化。在接受處死處理的過程中,小鼠因神經系統的過度氧化應激反應,神經系統受到刺激,細胞通透性改變,腦血流量減少。當給予小鼠七氟醚干預后,小鼠BDNF/TrKb/CREB基因與蛋白表達水平均升高,表明七氟醚能夠激活BDNF/TrKb/CREB信號通路,TrKb是一種器官保護因子,在細胞質中與CREB結合形成復合物。當機體內出現大量氧化因子,BDNF受到激活,與CREB解離進入細胞核,與抗氧化元件結合,高度激活多種抗氧化基因,CREB作為TrKb下游關鍵因子,在細胞應激過程中間接發揮著抗氧化作用[12-14]。

七氟醚對發育中大腦的促凋亡作用的機制尚不清楚,可能與其他吸入麻醉藥有共同的作用機制,如GABA受體的激活,神經營養因子受體的激活。早期接觸麻醉藥物導致持久損害的原因可能是神經元受損的易感性不局限于新生期動物,可以延續至成年動物,如海馬齒狀回和嗅球[13-15]。有研究發現人類的一些腦區如海馬,神經元在髓鞘形成的階段受到傷害,此效應將持續到青春晚期[16-18]。有研究發現七氟醚可顯著促進新生鼠海馬神經元的凋亡,本研究結果與其一致[1-2]。海馬神經細胞結構、功能、代謝活動受損傷將會造成學習記憶能力、行為能力等腦的高級功能活動能力降低[19]。

綜上所述,七氟醚能夠上調小鼠海馬組織中 BDNF mRNA、Trkb mRNA、CREB mRNA水平,而該機制可能與小鼠海馬組織抗氧化能力的提升以及保護小鼠海馬組織結構不受損傷有關。