腸道菌群代謝物TMAO對兔動脈粥樣硬化斑塊形成及狹窄程度的影響

路懷志,池 堯,趙 輝,許學(xué)升

(1.商丘市第一人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,河南 商丘476000;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 心內(nèi)科,吉林 長春130041)

冠心病在世界范圍內(nèi)依然是威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題[1]。因此,早期發(fā)現(xiàn)加速斑塊產(chǎn)生或者加快其發(fā)展速度的因素,對于降低疾病發(fā)生率具有重要意義。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物是近年來研究熱點(diǎn),已有研究證明其與動脈硬化疾病存在一定相關(guān)性[2]。氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide,TMAO),作為腸道菌群代謝產(chǎn)物之一,其高水平與臨床不良心血管事件發(fā)生呈正相關(guān)[3-4],但TMAO是否具有直接促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成及進(jìn)展的作用缺乏研究數(shù)據(jù)。本研究以新西蘭兔為研究對象,通過TMAO干預(yù)與阻斷,來評估TMAO對于斑塊形成及血管管腔狹窄程度的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康純種雄性新西蘭白兔32只,體重3～4 Kg,購自鄭州兔爾康牧業(yè)有限公司,飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)條件下,實(shí)驗(yàn)方案符合鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心要求,并經(jīng)鄭州大學(xué)動物研究委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.2主要器材及試劑 冰凍切片機(jī)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號 CRYOSTAR NX50];成像系統(tǒng)(日本尼康,型號 NIKON DS-U3);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);通用型組織固定液、HE 染液套裝、EVG 染液套裝、Masson 染液套裝、油紅染液、蘇木素染液、分化液及返藍(lán)液(Servicebio公司);氯化膽堿、DMB試劑(阿拉丁公司);飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1將兔隨機(jī)分為A、B、C、D共4組,每組8只,A組為空白對照組:普通飼料喂養(yǎng);B組為模型組:低溫氣體損傷+高脂飲食(1%膽固醇+8%豬油+10%蛋黃粉+兔基礎(chǔ)飼料);C組為TMAO組:低溫氣體損傷+高脂飲食+氯化膽堿灌胃(1.5%氯化膽堿無菌生理鹽水4 ml,可促進(jìn)TMAO的產(chǎn)生,每天1次)。D組為TMAO抑制組:低溫氣體損傷+高脂飲食+氯化膽堿灌胃+TMAO抑制劑飲水[含1.0%的3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)]。

1.2.2造模方法 B、C、D組兔高脂喂養(yǎng)1周后進(jìn)行內(nèi)膜損傷。建模步驟:①3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉及備皮后暴露右側(cè)頸總動脈。②阻斷血流并留置裝置:利用動脈夾阻斷遠(yuǎn)心端血流后再以同樣方法阻斷近心端血流。注射器針頭于分離動脈的遠(yuǎn)心端刺入血管,生理鹽水沖洗血管管腔,從近心端使用靜脈輸液針平行于血管縱軸方向刺入血管并留置。③進(jìn)行低溫氣體損傷:于液氮治療儀中注入液氮200 ml,封閉后快速連接靜脈輸液針。封閉液氮治療儀后端通氣孔后液氮由槍頭噴出并氣化為低溫氣體,氣體經(jīng)靜脈輸液針導(dǎo)入血管,頸動脈被低溫氣體充盈,出現(xiàn)膨脹,并由遠(yuǎn)心端穿刺孔噴出,持續(xù)5 s后放開液氮治療儀后端通氣孔,如此過程反復(fù)進(jìn)行3次。④損傷后處理:用生理鹽水沖洗動脈管腔后,進(jìn)行壓迫止血,止血后青霉素生理鹽水沖洗手術(shù)切口,縫合皮膚創(chuàng)口并以碘伏消毒。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素鈉40萬單位預(yù)防感染。A組兔,不進(jìn)行低溫氣體損傷,余操作同其他組。術(shù)后各組繼續(xù)喂養(yǎng)12周。低溫氣體輸出裝置:由液氮治療儀、一次性使用靜脈輸液針構(gòu)成。

1.2.3血清學(xué)指標(biāo)檢測 分別于高脂飲食前、血管損傷后12周,采集兔外周血,檢測各組血脂及TMAO水平。

1.2.4血管病理組織學(xué)切片 留取血管標(biāo)本后行HE染色、Masson三色染色、彈力纖維染色及油紅O染色。利用Image-Pro Plus 6.0測算斑塊面積,狹窄率(斑塊的像素面積/管腔的像素面積×100)。并對斑塊狹窄程度及TMAO濃度進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

B組1只白兔因腹瀉死亡,A、C、D組各1只白兔因麻醉過量死亡,余動物均完成實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組血脂水平比較

與高脂飲食前比較,模型組、TMAO組及TMAO抑制組喂養(yǎng)13周后HDL-C差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但LDL-C、TC、TG水平均顯著增高,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高脂飲食13周后3組間HDL-C、LDL-C、TG、TC差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與對照組比較,3組LDL-C、TC、TG水平均顯著增高,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組間LDL-C、HDL-C、TC、TG水平對比

2.3 4組間血清TMAO水平比較

喂養(yǎng)13周后TMAO組血清TMAO水平較余3組差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),較喂養(yǎng)前亦有顯著性升高(P<0.05)。其余3組間TMAO水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 4組間TMAO水平對比

2.4 血管斑塊染色比較

4組血管分別進(jìn)行了HE、Masson、彈力纖維及油紅O染色評估斑塊形態(tài)及管腔狹窄情況。可見A組血管管腔內(nèi)皮細(xì)胞完整,中層平滑肌細(xì)胞形態(tài)及排列正常,無斑塊形成,無脂質(zhì)沉積(見圖1A、B、C、D)。B組血管可見斑塊形成(圖1E),Masson三色染色膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)染,表達(dá)豐富,中膜平滑肌細(xì)胞與心外彈力板排列整齊(圖1F);中層彈力纖維呈現(xiàn)規(guī)律的彎曲改變,無血管重構(gòu)表現(xiàn)(圖1G),少量脂質(zhì)沉積(圖1H)。C組血管從切片上來看,斑塊纖維帽薄(圖1I),脂質(zhì)核心較大(圖1I、1L),內(nèi)膜中各種來源的泡沫細(xì)胞豐富,Masson三色染色顯示纖維帽中藍(lán)染的膠原纖維散在,含量明顯偏少(圖1J),彈力纖維染色中,部分血管中膜彈力纖維被牽拉變直,中膜變薄(圖1K),均符合典型的易損斑塊特點(diǎn)。D組血管表現(xiàn)整體情況類似B組(圖1M、N、O、P),有斑塊形成,但較C組斑塊相對較小,結(jié)構(gòu)更加完整。

圖1 4組目標(biāo)血管分別進(jìn)行了HE、Masson、彈力纖維及油紅O染色[A:對照組血管HE染色(×40),可見血管內(nèi)膜、中膜及外膜結(jié)構(gòu)完整,無斑塊形成;B:對照組血管Masson染色(×40),血管壁膠原纖維豐富;C:對照組血管彈力纖維染色(×40),血管彈力板結(jié)構(gòu)完整;D:對照組血管油紅O染色(×40),血管內(nèi)無脂質(zhì)沉積;E:模型組HE染色(×40),可見血管管腔內(nèi)斑塊形成;F:模型組Masson染色(×40),血管壁膠原纖維豐富;G:模型組彈力纖維染色(×40),血管彈力板結(jié)構(gòu)完整;H:模型組油紅O染色(×40),血管內(nèi)存在脂質(zhì)沉積;I:TMAO組HE染色(×40),管腔可見明顯斑塊形成;J:TMAO組Masson染色(×40),纖維帽薄,斑塊整體膠原纖維含量少;K:TMAO組彈力纖維染色(×40),彈力板破損,城墻樣形態(tài)消失,部分?jǐn)嗔?L:TMAO組油紅O染色(×40),斑塊富含脂質(zhì),并形成脂質(zhì)核心;M:TMAO抑制組HE染色(×40),血管內(nèi)斑塊形成,但體積較小;N:TMAO抑制組Masson染色(×40),斑塊膠原纖維含量較多,纖維帽較厚;O:TMAO抑制組彈力纖維染色(×40),彈力板相對完整,形態(tài)輕度改變;P:TMAO抑制組油紅O染色(×40),部分脂質(zhì)沉積,未見脂質(zhì)核心]

2.5 4組血管斑塊面積及狹窄率對比

各組管腔面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組未見明顯斑塊形成,斑塊面積及狹窄率與余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TMAO組斑塊面積顯著大于模型組、TMAO抑制組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),管腔平均狹窄率74.38%,均高于模型組與TMAO抑制組。模型組與TMAO抑制組組間斑塊面積及狹窄率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 各組間斑塊面積、管腔面積及狹窄率對比

2.6 血清TMAO濃度與斑塊狹窄程度的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示,血清TMAO水平與管腔狹窄率呈正相關(guān)(r=0.61,P<0.01;圖2)。

圖2 血清TMAO濃度與狹窄程度的相關(guān)性分析

3 討論

本研究以低溫氣體直接損傷血管內(nèi)皮,模擬高血壓、糖尿病、吸煙等心血管危險(xiǎn)因素對血管內(nèi)皮的損傷,并輔以高脂飲食,建立動脈粥樣硬化斑塊模型[5]。從病理切片上來看,除空白對照組外,均形成了動脈硬化斑塊,說明造模成功。在本研究中,TMAO與 TG、HDL-C、LDL-C、TC等血脂指標(biāo)無明顯相關(guān)性,與劉振東等[6]研究一致。

TMAO促進(jìn)了斑塊的形成并增加不穩(wěn)定性傾向。雖然內(nèi)皮損傷后給予高脂飲食,均可大概率引起動脈硬化斑塊形成,但TMAO組,因高膽堿飲食的干預(yù)引起TMAO水平的升高,斑塊有著更大的脂質(zhì)核心,而模型組及TMAO抑制組,脂質(zhì)核心并不明顯。目前研究發(fā)現(xiàn),含有大脂質(zhì)核心的斑塊,易于破裂繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致血管阻塞,引起急性心血管事件[7]。同時(shí),模型組及TMAO抑制組有著更厚的纖維帽,斑塊內(nèi)膠原纖維更為豐富。斑塊肩部纖維帽受血管應(yīng)力影響較大,若斑塊纖維帽內(nèi)膠原纖維缺乏,易導(dǎo)致纖維帽發(fā)生破裂[8]。彈力纖維顯色中可以看到,TMAO組部分內(nèi)彈力板破損,部分血管中膜彈力纖維被牽拉變直,血管中膜變薄,甚至中膜消失后內(nèi)膜與外膜相接,展示了血管重構(gòu)的一面,而模型組及TMAO抑制組血管整體結(jié)構(gòu)基本未見顯著被侵蝕改變,這種斑塊更加穩(wěn)定。TMAO促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定性,可能與積極地參與了動脈粥樣硬化過程中的各種生物反應(yīng)相關(guān)。動物研究中發(fā)現(xiàn),高濃度TMAO能通過ROS-TXNIP通路誘導(dǎo)TXNIP-NLRP3炎性體的活化,以劑量和事件依賴性的方式促進(jìn)白介素-1β(IL-1β)的成熟和分泌,并且增加白介素-18(IL-18)等炎癥因子的表達(dá)[9],從而引發(fā)炎癥和免疫反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷,并最終影響AS斑塊的進(jìn)展。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)證明,TMAO能通過NLRP3通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,上調(diào)IL-1β、腫瘤破壞因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達(dá)[10],導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的募集、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、加重內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,進(jìn)而對AS的進(jìn)展產(chǎn)生影響。此外,利用經(jīng)TMAO誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的實(shí)驗(yàn)證明了在TMAO能使EPCs上調(diào)IL-6、CRP、TNF-α、ROS以及減少了NO的產(chǎn)生[11]。TMAO還能通過促有絲分裂原活化的蛋白激酶和NF-kB信號加重炎癥,下調(diào)抗炎因子白介素-10(IL-10)表達(dá)[12]。這些炎癥因子表達(dá)的增加,加速了AS的形成和發(fā)展,并可促進(jìn)急性斑塊破裂事件的發(fā)生。因此,TMAO的過表達(dá)促進(jìn)斑塊炎癥反應(yīng),可引起斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,顯著增加斑塊破裂出血風(fēng)險(xiǎn),引起急性心腦血管事件的發(fā)生。

通過斑塊測量數(shù)據(jù),本研究中3組間管腔面積未有明顯差異,但TMAO組斑塊面積及狹窄程度顯著偏大,平均狹窄74.38%,遠(yuǎn)高于其余兩組。斑塊面積及狹窄程度很大程度上決定了患者的臨床癥狀,同時(shí),斑塊負(fù)荷重的易損斑塊更易出現(xiàn)破裂閉塞[13],增加急性心血管事件,并增加冠脈介入干預(yù)或冠脈搭橋手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)。通過Pearson相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)斑塊造成的管腔狹窄率與TMAO濃度存在正相關(guān)。可見,TMAO的過表達(dá)對斑塊的形成及發(fā)展均有重要影響,斑塊體積及管腔狹窄的增大均可顯著增加臨床冠脈血運(yùn)重建治療的機(jī)率。

因此,本研究結(jié)果顯示腸道菌群代謝物TMAO對血脂并無顯著性影響,但其表達(dá)增加后可促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生,并加重斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積,增加狹窄程度,增加斑塊的不穩(wěn)定性并可能引起急性血栓事件,對其抑制后有改善作用。但本研究存在一定局限性,一是樣本量偏小,統(tǒng)計(jì)可能有一定偏倚,二是TMAO影響動脈硬化斑塊產(chǎn)生與發(fā)展的具體機(jī)制如何,本研究并未涉及。