雙氫青蒿素對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞分泌膠原及激活PI3K/AKT通路的影響

張素華,栗志英*,蔡安盛,姚曉華,杜相珠,行紅燕,郭永澤,馬景紅

(1.河北工程大學附屬醫院,河北 邯鄲056002;2.邯鄲市第一醫院,河北 邯鄲056002)

心肌纖維化常由于心臟多次短暫缺血、負荷過重、心肌炎等多種有害因素所致。研究顯示心肌組織中的膠原異常沉積為心肌纖維化病理學特征[1-2],引起心肌硬度增加、收縮能力下降,易發生心律失常、心室重構以及心功能不全等并發癥。心肌成纖維細胞數量增多和異常活化釋放大量基質成分為心肌纖維化的重要機制,也是疾病治療的關鍵點[3-4]。實驗表明血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是促進心肌發生纖維化的重要因子[5-6]。本研究采用AngⅡ孵育心肌成纖維細胞制備細胞模型,經雙氫青蒿素(DHA)干預后,分析細胞的數目及分泌膠原含量的變化,探究DHA抗心肌纖維化的作用機制,報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及藥品

乳鼠:SD種屬,1～3 d,購自鄭州大學醫學部動物研究所。

藥品:AngII 購于上海源葉生物公司;DHA 購于西安展迅生物公司;波形蛋白,Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白,α-SMA,p-PI3K,p-AKT的第一抗體購于Invitrogen公司;羥脯氨酸檢測試劑盒均購于艾迪抗生物公司。

1.2 方法

1.2.1獲取心肌成纖維細胞 取12只出生第2 d的SD大鼠,麻醉并用酒精消毒后,無菌條件下摘取心臟,剪下心室放置于冰浴的孵育液中,清洗并剪成細小組織塊,胰酶消化、過濾后的濾液置于離心機(D=12 cm)里離心獲得細胞,然后用孵育液培養,利用不同細胞差時貼壁的特點,純化成纖維細胞,孵育2 d時鑒別細胞類型和形態觀察。

1.2.2細胞分組 成纖維細胞等量分為:正常組、DHA組、AngⅡ組和DHA+AngⅡ組。正常組:僅有孵育液;AngⅡ組:孵育液中有AngⅡ(10-6mol/L);DHA組:孵育液中有DHA(100 ng/mL);DHA+AngⅡ組:孵育液中有Ang(10-6mol/L)Ⅱ和DHA(100 ng/mL)。

1.2.3細胞增殖的檢測 將細胞用孵育液調配為5×104個/ml,移植到96孔培養板中,每孔均為200 μl,孵育24 h時細胞生長為同步化狀態,每組細胞均重復安排6個孔,孵育48 h后,滴加噻唑藍染液20 μl,孵育4 h。清除各孔溶液,加二甲基亞砜,震蕩幾分鐘后于適當長度波下讀取每孔的吸光度值。

1.2.4孵育液中羥脯氨酸含量的檢測 提前備好3個管,分別放入等量的三蒸水、標準液體及細胞孵育24 h后的懸浮液,各管中滴加適量的消化液,37℃反應3 h。依次按照試劑盒的說明步驟加入試劑1、2、3,最后離心獲得上清液放入比色杯中,于分光光度計中檢測吸光值。

1.2.5胞質內ColⅠ、Col Ⅲ蛋白的檢測 各組細胞均孵育2 d后,獲取胞質內的所有蛋白,80 μg變性蛋白移入凝膠孔里,電泳分離目的蛋白后,印跡到薄膜上,薄膜浸入封閉液中1 h,再浸入第一抗體ColⅠ(1∶800)、Col Ⅲ(1∶600)、α-SMA(1∶500)、p-PI3K(1∶600)、p-AKT(1∶800)稀釋液中,4℃反應過夜,第二天移至第二抗體(1∶1 000)稀釋液中反應2 h,3次洗膜后于暗室中進行化學發光實驗,把蛋白條帶顯影并定影于X光片上,晾干后分析膠片上的光密度值。

2 結果

2.1 觀察細胞的形態結構與性質鑒定經1.2.1方法所得的細胞純度大于90%,培養瓶中的細胞在鏡下可見:細胞貼壁生長,第3天時可見細胞體積變大,從胞體伸出長短、粗細不等突起,單個圓形核,位于細胞中央。經免疫細胞化學法染色見細胞內的波形蛋白染為棕黃色,見圖1。

圖1 上皮細胞的形態結構與性質鑒定(×400)

2.2 細胞增殖實驗結果細胞的吸光度值能反映其增殖情況,DHA組與正常組之間無明顯差異(P>0.05),AngⅡ組比正常組升高(P<0.05);DHA+AngⅡ組比AngⅡ降低(P<0.05),見表1。

表1 各組細胞增殖及羥脯氨酸實驗結果分析

2.3 細胞懸浮液中羥脯氨酸的檢測結果用懸浮液的吸光值評估其中羥脯氨酸的含量,DHA組與正常組之間無明顯差異(P>0.05),AngⅡ組比正常組升高(P<0.05);DHA+AngⅡ組比AngⅡ降低(P<0.05),見表1。

2.4 胞質內指定蛋白的檢測結果蛋白條帶的相對灰度值評估ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA、p-PI3K、p-AKT的含量,DHA組與正常組之間無明顯差異(P>0.05),AngⅡ組比正常組升高(P<0.05);DHA+AngⅡ組比AngⅡ降低(P<0.05),見圖2、表2。

表2 胞質內ColⅠ和Col Ⅲ蛋白灰度值的分析

圖2 胞質內ColⅠ、Col Ⅲ等蛋白灰度條帶的顯示

3 討論

心肌纖維化是發展為心功能障礙的主要心臟疾病之一,心肌細胞在缺血、炎癥等多種有害因素的作用下受到損傷時,其自身不能再生,主要依靠間質細胞分泌大量基質成分的方式進行修復,其顯著的病理學特征表現為心肌細胞之間有大量的膠原蛋白異常聚集[7-8]。間質細胞中的成員之一成纖維細胞,在此修復過程中扮演著重要的角色。在有害信號的刺激下,成纖維細胞轉分化為間充質性質的細胞,增殖分裂能力增強,釋放大量的以膠原為主的基質成分,從而使心肌間質里出現纖維化病理改變[9-10]。

研究顯示,Ang II作用于心肌間質中的成纖維細胞,使其轉分化為具有a-SMA表型分子的間充質細胞,分裂出大量的細胞,向細胞外釋放大量的膠原蛋白,其中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白占較大比例,同時合成多種致纖維化因子如TGF-β1等,促進了心肌纖維化的發展[11-13]。本研究結果表明,AngⅡ作用于成纖維細胞后,其數量增多,細胞表型分子a-SMA的含量增加,釋放到懸浮液中的羥脯氨酸(膠原分子的主要成分)含量升高,同時胞質內合成的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量也增加。

QIN等[14]報道PI3K/AKT信號通路在調節心肌細胞纖維化發生、發展的過程中起著十分重要的作用,此信號通路能通過調節細胞自噬、凋亡、生長以及一系列分子轉錄相關基因來影響心肌纖維化的進程。NIE等[15]實驗研究顯示,利用阿霉素建立大鼠心肌纖維化模型,經過硫化氫干預后,通過增強 PI3K/AKT/mTOR 信號通路的表達來調節自噬達到改善心肌纖維化的作用。趙研等[16]采用Ang II制備的大鼠原代心肌細胞纖維化模型中PI3K/AKT信號通路被活化,導致a-SMA的含量增加和大量膠原蛋白的產生,二參真武湯能明顯抑制此通路的活性并有效改善心肌細胞的纖維化程度。

雙氫青蒿素是中草藥青蒿素的衍生物之一,除了具有抗瘧功效外,它還能發揮拮抗腫瘤、降低炎癥、增強免疫等生物學作用[17]。在肝臟組織纖維化的實驗小鼠采用適量的雙氫青蒿素治療一段時間后,組織中的纖維化病變得到了改善,肝功能也較治療前增強[18]。宋玉杰等[19]體外實驗中,TGF-β1刺激子宮內膜的間質細胞,發現其增殖能力和活性均增強,經雙氫青蒿素干預后,此種效應減弱。本實驗數據揭示,雙氫青蒿素能通過降低PI3K/AKT通路的活性抑制AngⅡ刺激的心肌成纖維細胞增殖、分化和分泌膠原的含量,從而達到改善心肌纖維化的作用。