基于球包球填料的液質聯用技術應用考察

徐靈佳，郭欣桐

（寧夏職業技術學院，寧夏銀川 750021）

隨著質譜分析技術迅速發展，液相色譜串聯質譜聯用系統分析已經成為最廣泛應用的蛋白質復合物分離鑒定研究方法[1-3]。而前端采用納流液相色譜的液質聯用方法，更是大大突顯了液質聯用高效率、高分辨、高靈敏度以及低進樣量的優勢[4]。因此，如何進一步提高前端色譜分離的效率和效果是目前蛋白質組學分析亟需解決的問題。

球包球填料[5]是一種新型的殼-核色譜填料，它優化了色譜動力學過程，在之前的研究中色譜分離效果良好[6]。通過改變表面納米小球的殼厚度，可以將色譜填料調整到適宜尺寸的孔隙，從而適用于分離生物大分子。

本實驗采用這種新型球包球殼-核式反相色譜填料填充納流液相色譜柱，探究色譜柱的柱性能，并構建了液質聯用平臺，探究此平臺在牛血清白蛋白酶解產物分析中的應用，從而預測其未來在蛋白質組學分析中的應用潛能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與試劑

材料：內徑100 μm，外徑375 μm 的透明涂層毛細管（永年銳灃色譜器件有限公司）。

試劑：乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）、超純水、尿素、NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶。

樣品：牛血清白蛋白（BSA）。

1.2 實驗儀器及數據處理

實驗儀器：Vario EL III 元素分析儀（Elementar，Germany）；日立S-4800 掃描電鏡（Hitachi，Japan）；納流液相色譜串聯質譜聯用平臺由Waters ACQUITY 超高壓液相色譜系統（Waters，Milford，MA，USA）和QExactive 高性能臺式四級桿-軌道阱質譜儀（Thermo Scientific，USA）組成，分析柱由球包球填料填充而成。

數據處理：將Q-Exactive 質譜分析得到的raw 文件用Proteome Discoverer（Version 1.40，Thermo Fisher）進行檢索，數據庫為Uniprot-Bovine。

1.3 球包球填料毛細管柱性能檢測

1.3.1 柱截面填充情況檢測 采用勻漿法填充3 根15 cm 長的球包球填料毛細管柱，每根色譜柱以每2 cm 為1 節點按照垂直于色譜柱方向截斷，用掃描電鏡觀察其柱床填充情況。

1.3.2 球包球填料元素含量分析 將球包球填料（SOS-ODS）、A scentis Express C18、HALO C18（AMT，Inc.）、Kinetex C18（Phenomenex）、Poroshell 120（Agilent）5 種填料各取適量，分2 份包裹在錫箔中，稱重之后放入自動樣品進樣器的旋轉式進樣盤中進行元素分析。

1.4 納流液相色譜串聯質譜聯用系統分析

1.4.1 牛血清白蛋白的酶解 蛋白質酶解樣品是通過胰蛋白酶在溶液里酶解標準蛋白而獲得的。首先，蛋白質被溶解在8 mol/L 尿素、0.05 mol/L NH4HCO3的溶液中。然后，蛋白質被DTT 分解，被IAA 烷基化。最后，胰蛋白酶以50∶1 的比例加進去，酶解過夜。

1.4.2 納流液相色譜體系流動相的配制 分別配制流動相，A 相（水相）：H2O+0.1%TFA；B 相（有機相）：ACN+0.1%TFA；C 相：50%ACN。

1.4.3 梯度洗脫 液相的流量為300 nL/min。流動相梯度為0～5 min，2%～10%B；5～85 min，10%～35%B；85～105 min，35%～65%B；105～110 min，65%～95%B；110～120 min，95%B。

2 結果與討論

2.1 色譜柱截面的掃描電鏡

為了解球包球填料填充的納流液相色譜柱的柱床微觀結構，探求其對色譜分離效能的影響，使用掃描電鏡對色譜柱截面進行了觀察，見圖1。由圖1 可以看出，球包球填料高度均一，但由于填料表面布滿了納米小球，表面比較粗糙，納米小球彼此之間擠壓，造成填充柱床中的空腔較多，孔隙較大。柱床中的大孔隙雖然可以降低色譜分離時的背壓，提高分離速度，但是對于復雜多肽混合物的分離效果可能不利。

圖1 球包球填料毛細管柱的掃描電鏡圖

2.2 球包球填料元素含量分析

對于反相色譜填料來說，C18 的修飾決定了蛋白多肽等生物分子的保留情況，因此，探究色譜填料的碳載量尤為重要。本實驗對球包球填料和4 種商業化的反相色譜填料進行元素分析，見表1。

表1 5 種色譜填料的元素分析表

由表1 可以看出，球包球填料的平均碳載量相對較低，這可能會影響到色譜分離時生物分子的保留情況，可能需要更長的洗脫時間和洗脫梯度才能達到較好的分離效果。

2.3 納流液相色譜串聯質譜聯用系統分析

利用球包球填料填充的毛細管柱構建納流液相色譜串聯質譜聯用分析平臺，對標準蛋白牛血清白蛋白（BSA）酶解進行分離，得到BSA 酶解產物的質譜總離子流圖見圖2。由圖2 可知，球包球填料對小分子多肽的混合物分離效果良好。由圖3 可知，在此平臺下對BSA 酶解產物進行分析鑒定，肽段匹配很高。通過搜庫結果可知，肽段的覆蓋率可達63.90%，由此證明了球包球填料高效的色譜分離能力和液質聯用在蛋白質組學分析的應用潛能。

圖2 BSA 酶解產物的質譜總離子流圖

圖3 BSA 酶解產物中肽段匹配情況

3 結語

本實驗利用球包球填料填充納流液相色譜分析柱，對其柱床性能進行了簡單考察，成功構建了納流液相色譜串聯質譜聯用分析平臺，并采用液質聯用法對牛血清白蛋白酶解產物進行了分析鑒定。球包球填料的納流液相色譜柱床孔隙較大，可能與其表面過于粗糙有關。球包球填料平均碳載量相對較低，影響生物分子保留，后續還需要進一步優化。盡管如此，球包球填料依舊顯示出它在色譜上的高效分離，由其建立的液質聯用在蛋白質組學分析上具有巨大應用潛能。