谷胱甘肽還原酶影響結(jié)腸癌代謝及預(yù)后:一項基于蛋白組學(xué)與微陣列芯片分析的研究

吳 懼,常耀元,李子群,尹家俊,王禹堯

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 肝膽外科·大連市腫瘤生物醫(yī)療和基因檢測重點實驗室,遼寧 大連116001)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上最常見的三大癌癥之一,在死亡率方面排名前兩位,據(jù)統(tǒng)計2020年全球有1 931 590例新發(fā)病例和935 173例死亡病例[1-2]。近幾年,隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展,腫瘤分子靶點和生物治療逐漸成為臨床治療的有力手段[3]。在過去的幾十年里,靶向癌癥代謝受到了廣泛關(guān)注,因為腫瘤代謝在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,包括葡萄糖代謝、核酸代謝、酶代謝、蛋白質(zhì)代謝等[4]。GSR基因編碼谷胱甘肽(GSH)還原酶,位于8p12,在氧化還原穩(wěn)態(tài)和細胞抵抗氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[5]。谷胱甘肽是一種主要的細胞內(nèi)抗氧化劑,在維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、異生物代謝和硫醇平衡方面起著至關(guān)重要的作用[6-7]。本研究旨在探討GSR對結(jié)腸惡性腫瘤代謝、臨床特征以及預(yù)后的影響,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集5例結(jié)腸癌患者病理標(biāo)本(每例患者分別取結(jié)腸癌組織和對應(yīng)的正常結(jié)腸上皮組織),對樣本采用DIA(Data independent acquisition)質(zhì)譜技術(shù)進行差異蛋白分析。收集120例結(jié)腸癌患者(60例結(jié)腸癌+60例結(jié)腸癌合并肝轉(zhuǎn)移癌)原發(fā)灶病理標(biāo)本用以制作組織微陣列芯片。所有患者術(shù)前未行新輔助化療。本研究已獲得大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并獲得所有患者或家屬的知情同意。

1.2 生物信息分析

1.2.1蛋白組學(xué)分析 根據(jù)可信蛋白選擇兩個標(biāo)準(zhǔn)計算樣本間差異。Foldchange(FC)用于評估樣本間蛋白表達水平的倍數(shù)變化。采用t檢驗計算樣本間差異的P值。差值過濾條件為|log2(FC)|=1且P<0.05。基于R語言對數(shù)據(jù)和樣本進行無監(jiān)督層次聚類。

1.2.2KEGG富集分析 獲取DAVID數(shù)據(jù)庫中的差異表達蛋白,對差異蛋白進行KEGG富集分析,描述其功能。

1.2.3蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析和相關(guān)性分析 使用String分析工具進行PPI分析,并使用CytoHubba插件篩選出連接節(jié)點數(shù)最多的前10個蛋白。使用Timer網(wǎng)絡(luò)分析工具進行相關(guān)性分析。

1.2.4生存分析 使用網(wǎng)絡(luò)分析工具GEPIA2進行生存分析。

1.2.5臨床特征相關(guān)性分析 臨床特征相關(guān)性分析采用UALCAN網(wǎng)絡(luò)分析工具。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色采用DAB免疫組織化學(xué)染色試劑盒(zgb-bio,#ZLI-9018)。用GSR抗體(SAB,#31078,稀釋度:1∶100)孵育過夜,用蘇木精復(fù)染。所有染色結(jié)果由本中心的專業(yè)病理醫(yī)師觀察和分析。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異蛋白的比較采用Student’sT檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析方法。Kaplan-Meier生存分析采用logrank檢驗。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用ImageJ軟件進行分析,P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白的篩選與KEGG通路分析

蛋白組學(xué)差異分析結(jié)果共獲得1 536個差異蛋白,其中977個顯著上調(diào),559個顯著下調(diào)(圖1)。排除結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸上皮組織中未檢測到的蛋白,共鑒定出1 209個差異表達蛋白(P<0.05)。

圖1 差異蛋白篩選

對差異表達蛋白進行KEGG富集分析(圖2),1 209個差異蛋白中有144個蛋白顯著富集于代謝通路,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 KEGG功能富集分析

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵蛋白的獲取

通過Cytoscape軟件進行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,CytoHubba插件統(tǒng)計節(jié)點之間的連接數(shù),篩選出代謝通路富集的144個蛋白中連接節(jié)點數(shù)最多的前10個蛋白:ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS、GSR(圖3)。通過Timer數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)部分蛋白之間相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

2.3 關(guān)鍵蛋白的生存分析

使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫進行生存分析顯示,GSR低表達降低了結(jié)腸癌患者總生存期(P=0.0 017,HR=0.45),而ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5、ALDH18A1、ALDH3A1、GSTA1、GSTA2、HPGDS不影響結(jié)腸癌患者總生存期(圖5)。

圖5 Kaplan-Meier生存分析

2.4 GSR與臨床信息相關(guān)性分析

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫,分析GSR表達與結(jié)腸癌患者臨床信息的相關(guān)性(圖6)。與正常結(jié)腸上皮組織相比,GSR在結(jié)腸癌組織中的表達降低,其中GSR在Ⅰ期結(jié)腸癌中表達最高、在Ⅳ期結(jié)腸癌中表達最低,GSR在N1期和N2期的表達較N0期降低,發(fā)生TP53突變的結(jié)腸癌中GSR的表達下調(diào),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 GSR對臨床特征的影響

2.5 GSR免疫組織化學(xué)分析

使用組織微陣列芯片進行免疫組織化學(xué)染色(圖7)。微陣列染色結(jié)果顯示,正常結(jié)腸上皮組織(N)中GSR染色強度最高;合并肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織(CRLM)中GSR染色強度最低;未合并肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織(CRC)中GSR染色強度介于N和CRLM之間,3組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 微陣列芯片染色結(jié)果

3 討論

結(jié)腸癌仍然是醫(yī)學(xué)界的難題,也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。隨著腫瘤分子靶點和生物治療的不斷發(fā)展,特別是對腫瘤代謝認(rèn)識的不斷加深,為結(jié)腸癌的治療提供了新的信心和方向[8-9]。2017年的一項研究發(fā)現(xiàn),二氯乙酸通過減少糖酵解抑制結(jié)腸癌細胞的增殖,這項發(fā)現(xiàn)進一步凸顯了代謝因素在結(jié)腸癌發(fā)展中的重要性[10]。本研究蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌的1 209個差異表達蛋白中,有144個顯著富集于KEGG代謝通路,蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ADH家族、ALDH家族、GSTA家族、GSR和HPGDS蛋白在代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些結(jié)果支持了代謝因素在結(jié)腸癌中的重要作用。通過生存分析發(fā)現(xiàn),GSR高表達的結(jié)腸癌患者較低表達的結(jié)腸癌患者預(yù)后更好。2019年的一項研究中,GSR缺陷型肺癌被確定為硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶(TXNRD)抑制劑的可能靶點[11]。因此,GSR可能參與了結(jié)腸癌細胞代謝的重要步驟。

近年來,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以通過代謝影響免疫細胞的浸潤,進而影響免疫治療的療效和耐藥性。通過調(diào)控腫瘤的代謝,進而改變腫瘤的免疫微環(huán)境,為臨床腫瘤患者的免疫治療提供了新的思路與方向[12-19]。2020年MONSERRAT-MESQUIDA M 等[20]的一項關(guān)于代謝綜合征(MetS)的研究發(fā)現(xiàn),MetS以氧化應(yīng)激為特征,會導(dǎo)致炎癥、血管功能受損以及動脈粥樣硬化,并觀察到MetS人群中GSR的活性和蛋白水平較高,而體內(nèi)的循環(huán)白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞較低。這可能是因為高抗氧化應(yīng)激的防御能力使免疫細胞處于一種預(yù)激活狀態(tài),進而形成促炎狀態(tài),而腫瘤微環(huán)境中浸潤炎癥細胞的豐度與免疫檢查點抑制劑(ICIs)的療效密切相關(guān),考慮GSR可以作為一種免疫刺激劑,促進結(jié)腸癌細胞的免疫浸潤,進而提高臨床免疫治療的療效。有研究證明,趨化因子參與了結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的過程,從而導(dǎo)致癌細胞的遷移、黏附和趨化[21]。2019年的一項研究發(fā)現(xiàn)[22],長期接受阿霉素化療的患者,體內(nèi)GSR以及其他抗氧化應(yīng)激因子水平升高,同時IL-6、IL-8以及CXCL-1水平下降。在結(jié)腸癌中,GSR水平的升高,可能會導(dǎo)致某些趨化因子的活性或水平降低,當(dāng)GSR表達降低,對趨化因子的抑制作用被解除,進而導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移。本研究組織微陣列芯片免疫組化結(jié)果顯示,GSR在合并肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的表達顯著低于未合并肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織,這可能是因為GSR的下調(diào)導(dǎo)致趨化因子的活性與水平增加,進而促進了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。生存分析顯示,GSR在結(jié)腸癌中作為腫瘤抑制因子顯著改善患者預(yù)后,同時發(fā)現(xiàn),GSR與結(jié)腸癌患者的N分期、總分期和TP53突變相關(guān),因此考慮GSR可能在結(jié)腸癌中作為一種抑癌因子發(fā)揮保護作用,當(dāng)GSR表達下調(diào),這種保護作用被破壞,進而促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其具體機制將在未來進一步設(shè)計實驗來探索。

綜上,GSR在結(jié)腸癌代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并且其表達可能影響結(jié)腸惡性腫瘤的代謝、腫瘤分期、TP53突變以及結(jié)腸癌患者預(yù)后。